Grenser I Farmakologi

Introduksjon

Membranproteiner deltar i grunnleggende fysiologiske hendelser i hvert biologisk system fra bakterier til mennesker. >50% av markedsførte legemidler mål membranproteiner, mens den farmakologiske målretting av mange andre membranproteiner anses potensielt gunstig i mange biomedisinske applikasjoner (Overington et al ., 2006; Yıı, 2007; Arinaminpathy et al., 2009). De molekylære mekanismene som ligger til grunn for deres funksjon og regulering forblir imidlertid stort sett ukjente på grunn av mangel på strukturell informasjon. Faktisk, mens membranproteiner står for ~26% av det humane proteomet, representerer deres strukturer bare ∼2% av strukturene i Proteindatabanken (Fagerberg et al., 2010; Jørgen et al., 2016). Flere hindringer hindrer den strukturelle undersøkelsen av membranproteiner, og krever utvikling av toppmoderne teknologier for å belyse deres molekylære arkitekturer (Pandey et al., 2016; Jørgen et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula og Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). De store hindringene er at deres overuttrykk og rensing og strukturelle studier ved de fleste teknikker (F. eks. røntgenkrystallografi) forblir begrenset i mange tilfeller. Disse hindringene hindrer dermed den rasjonelle utviklingen av legemiddelkandidater rettet mot sykdomsrelaterte membranproteiner (Vinothkumar Og Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).Sekundære transportører Er membranbundne proteiner som selektivt katalyserer bevegelsen av dårlig permeable oppløsninger (f. eks., ioner, nevrotransmittere, narkotika) over cellemembranen, som støtter ulike cellulære funksjoner i helse og sykdom. Sekundære transportører overholder det vekslende tilgangsparadigmet, ifølge hvilket proteinligandbindingslommen blir alternativt tilgjengelig på motsatte sider av membranen ved å vedta de innovervendte (IF) og utovervendte (OF) tilstandene i rekkefølge (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Nylige gjennombrudd i strukturbiologien til membranproteiner ga et vell av strukturer av membranbundne transportører i forskjellige konformasjonelle tilstander (Drew og Boudker, 2016; Bai et al., 2017), som gir innsikt i deres transport-og løsningsgjenkjenningsmekanismer. Imidlertid gir de statiske øyeblikksbilder av en iboende flertrinnsprosess (Seeger, 2018). Dermed er det et økende behov for å utvikle nye tilnærminger for å undersøke membranproteiner dynamikk (Konermann et al., 2011; Smith et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al.( 2018; Burke, 2019). Disse inkluderer en kombinasjon av molekylær dynamikk (MD) simuleringer (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Jørgen et al., 2016; Jørgen et al., 2017; Harpole Og Delemotte, 2018) med avanserte eksperimentelle teknikker, inkludert spektroskopiske teknikker og enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (Smith et al., 2012; Jørgen et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula Og Ramamoorthy, 2019; Sun og Gennis, 2019).Hydrogen-Deuterium utveksling massespektrometri (HDX-MS) fått oppmerksomhet de siste årene for å studere membran proteiner dynamikk, selv om det har vært brukt i flere tiår for å karakterisere løselige proteiner (Konermann et al., 2011; Jørgen et al., 2017). HDX-MS overvåker tidsavhengig utveksling AV løsemiddel D2O med proteiner backbone amide hydrogen under naturlige forhold. Deuterium – valutakursen avhenger av løsningsmiddeltilgjengelighet, sekundær struktur og strukturell stivhet (Konermann et al., 2011). SAMMEN MED proteolytisk fordøyelse og peptid separasjon, HDX-MS tillater kvantifisering av valutakurser i korte protein segmenter, opp til single-rest oppløsning. TO store fordeler MED HDX-MS er at små proteinmengder (< 0,1 mg) kreves for analyse, og at kjemisk proteinmerking ikke er nødvendig, og unngår uønskede strukturelle forstyrrelser. Her oppsummerer vi nylige fremskritt og applikasjoner i BRUK AV HDX-MS for å studere transportørens strukturelle dynamikk.

Hydrogen-Deuterium Utveksling Masse-Spektrometri Prinsipper

HDX-MS prinsipper er kort og kvalitativt beskrevet nedenfor, for å tillate en diskusjon av sine programmer for å studere transportører. For grundige forklaringer er flere gode oversiktsartikler tilgjengelige (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen Og Wales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Jørgen et al., 2019; Redhair et al., 2019).

I HDX-eksperimenter utveksler deuterium med labile proteinhydrogen på en tidsavhengig måte etter proteinfortynning i EN D2O-buffer (Masson et al. 2017) (Figur 1). HDX-MS overvåker hovedsakelig utveksling av backbone amide hydrogenene siden i) ved nøytral pH de utveksles i priser som kan oppdages VED HJELP AV HDX-MS (sekunder til dager) og ii) deres utveksling kan effektivt slokkes (Marcsisin Og Engen, 2010; Gallagher og Hudgens, 2016). HDX-hastigheten avhenger av flere parametere. Amidhydrogenene kan utvise en «lukket tilstand» som stammer fra deltakelse i stabile hydrogenbindinger i sekundære strukturer eller fra løsningsmiddeltilgjengelighet, som ikke tillater utveksling med løsemiddel deuterium, eller en «åpen tilstand» der protonabstraksjon, DET hastighetsbegrensende trinnet AV HDX, kan forekomme (Oganesyan et al., 2018). I tillegg har reaksjonen en iboende kjemisk hastighetskonstant, som avhenger av pH, temperatur og restmiljøet (Oganesyan et al., 2018).

Figur 1 Skjematisk oversikt over arbeidsflyten for hydrogen-deuterium-utvekslingsmassespektrometri (HDX-MS). Proteiner er merket I D2O buffer for en forhåndsdefinert tid, etterfulgt av utveksling quenching og proteolyse. Peptidene separeres, og deres masse oppdages ved BRUK AV MS. Endelig beregnes mengden inkorporert deuterium i hvert peptid for hvert tidspunkt.

overgangen mellom lukkede og åpne tilstander skjer ved lokale utfoldende hendelser. UNDER innfødte forhold, hvor proteiner er godt brettet, AVHENGER HDX-hastigheten hovedsakelig av overgangshastigheten tilbake til lukket tilstand (Weis et al., 2006). Hvis den utfoldede proteinregionen vender tilbake til lukket tilstand med en hastighet som er mye langsommere enn den kjemiske valutakursen, observeres EX1 kinetikk, noe som resulterer i korrelert deuteriumopptak i nærliggende rester. Dette resulterer i to populasjoner: en med lav m / z og en med høy m / z, som reflekterer peptider fra proteinmolekyler som ikke har og som har gjennomgått utveksling, henholdsvis. Med tiden blir den høye m/z-befolkningen mer fremtredende på bekostning av den lave m/z-befolkningen. EX1 kinetikk anses sjelden i foldede proteiner under naturlige forhold, men kan induseres, for eksempel ved tilsetning av denaturanter (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Hvis proteinet vender tilbake til lukket tilstand med en hastighet mye raskere enn den kjemiske valutakursen, OBSERVERES EX2 kinetikk. Her avhenger utvekslingen av overgangen av individuelle rester mellom åpen og lukket tilstand, som forekommer på en ukorrelert måte. Således observeres med tiden en enkelt befolkning med gradvis økende m/z-verdier (Weis et al., 2006).

etter deuteration blir reaksjonen slukket ved forhåndsdefinerte tidspunkter ved å endre pH fra nøytral (7)til pHmin (2,5-3), noe som resulterer i ~10,000-fold reduksjon I HDX (Konermann et al ., 2011; Jørgen et al., 2017; Oganesyan et al., 2018) ; og ved å redusere temperaturen fra 25 til 0°C, som fører til ~14 ganger reduksjon I HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Deretter fordøyes proteinet ved hjelp av en protease og peptidene separeres ved hjelp av analytisk revers-fase kromatografi. For TIDEN ligger den store tekniske flaskehalsen TIL hdx-MS-eksperimenter i å oppnå en høy sekvensdekning, som er begrenset av motstanden mot fordøyelsesenzymer og ved proteolytiske forhold. Endelig identifiseres eluerte peptider ved BRUK AV MS, OG GRADEN AV HDX beregnes ut fra de oppnådde m/z-verdiene. De eksperimentelle detaljer og fallgruver av protein fordøyelse, peptid separasjon, OG MS identifikasjon er utenfor rammen av denne gjennomgangen (Konermann et al ., 2011; Masson et al., 2017; Jørgen et al., 2019).

Hydrogen-Deuterium Utveksling Masse-Spektrometri Studier Av Membranproteiner

Til tross for deling av vekslende tilgang paradigme, ligand-indusert konformasjonsendringer varierer blant transportører på grunn av forskjeller i ligand-protein interaksjoner. For eksempel, symporters (co-transport to eller flere ligander) kan overgang MELLOM IF og stater uten bundet ligander, mens ligand binding er obligatorisk for å bytte MELLOM IF og stater i antiporters (utveksling ligander på motsatte sider av membranen) (Forrest et al., 2011; Drew Og Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

generelt er det vanskelig å oppdage lokale ligand-induserte dynamiske endringer i proteiner. For eksempel er krystallstrukturer av membranproteiner i både ligandfrie og ligandbundne former ofte utilgjengelige, og utelukker deteksjon av ligandinducerte konformasjonsendringer selv for proteiner med kjente strukturer. Videre kan høyoppløselige strukturelle øyeblikksbilder av apo – og ligandbundne tilstander ikke løse betydelige konformasjonsforskjeller. Små ligandinduserte konformasjonsendringer kan imidlertid påvises VED BRUK AV HDX-MS ved spesifikke proteinunderdomener under native forhold ved å måle differensielt deuteriumopptak (HRYVDX) i nærvær og fravær av ligander. DENNE EVNEN TIL HDX-MS gir unike muligheter for å ta opp de mest utfordrende problemene i å belyse mekanismene for ligand-protein og protein-protein interaksjoner (Rand et al., 2014; Jørgen et al., 2019; Redhair et al., 2019), som omtalt her for en rekke nylig studerte transportørproteiner.

Konformasjonsoverganger Underliggende Vekslende Tilgang: Na+ / H + Antiporter

Nha-proteiner regulerer cellulær pH, og volum gjennom livets riker (Padan Og Landau, 2016). Den viktigste strukturelle modellen som brukes til å studere nha-orthologer er Escherichia coli NhaA, for hvilken en krystallografisk struktur av inaktiv tilstand ved sur pH er tilgjengelig (Hunte et al., 2005). FOR å studere den strukturelle dynamikken Til NhaA under fysiologisk pH, BLE HDX-MS nylig brukt (Eisinger et al., 2017). Avgjørende for innsiktene som er oppnådd i denne studien, GIR HDX-MS globale dynamiske data, i motsetning til metoder basert på stedsspesifikk merking, som bare oppdager bevegelser av forhåndsdefinerte proteinregioner.

i denne studien ble det oppnådd en eksepsjonelt høy sekvensdekning på 88,5% For NhaA i vaskemiddel, noe som gir innsikt i mekanismen som ligger til grunn for vekslende tilgang ved ligandbinding. VED å sammenligne HDX-mønstrene mellom apo – og substratbundet Nha, ble det observert ET tilbakevendende MØNSTER AV HDX-endring i flere helikser, hvor økt deuteriumopptak i en ende ble ledsaget av redusert deuteriumopptak i den andre enden. Opptaket i midten av helices var stort sett uendret.basert På DET observerte mønsteret AV HDX-endring, selv om DET ikke direkte gir romlig informasjon, ble det foreslått at oversettelse av transmembrane helikser i forhold til membranen forekommer, som reflektert i de gjensidige HDX-endringene observert for DE to termini innenfor spesifikke transmembrane helikser. Denne modellen er i samsvar med den» heislignende » mekanismen for vekslende tilgang, noe som innebærer en vertikal oversettelse av transmembrane helices under transportsyklusen (Ryan og Vandenberg, 2016). Oppsummert ga HDX-MS ny innsikt i de strukturelle overgangene som er involvert i vekslende tilgang, uoppnåelig av de tidligere løste strukturer av den inaktive NhaA.

Effekt Av Protein-Lipid Interaksjoner på Transportører Konformasjon Landskap

de fleste sekundære transportører tilhører major facilitator superfamily (MFS), dele en konservert arkitektur til tross for sine ulike funksjoner (Radestock og Forrest, 2011). Selv om krystallstrukturer AV mfs medlemmer er tilgjengelige, de ga liten informasjon om protein-lipid interaksjoner og deres effekt på likevekten MELLOM AV OG IF stater. Dermed, Martens et al. kombinerte MD-simuleringer MED HDX-MS for å studere effekten av lipidmiljøet på tre godt karakteriserte transportører: laktosepermease, xylosetransportør og glyserol-3-fosfatantiporter (Martens et al., 2018).

Først ble en mutasjon kjent for å skifte likevekten mot AV-tilstanden introdusert på ekstracellulær vestibulen til alle transportører (Kumar et al., 2014). Sammenligning AV WT og muterte transportører VED HJELP AV HDX-MS viste at metoden oppdager konformasjonsendringen, med regioner på den ekstracellulære vestibulen som tar opp mer deuterium i mutantene vs. WT, mens det motsatte skjer for rester på intracellulær vestibulen. Deretter ble transportørene rekonstituert i nanodisker sammensatt av fosfatidylglycerol, tetraoleylkardiolipin og enten fosfatidylkolin eller fosfatidyletanolamin. Interessant nok skiftet tilstedeværelsen av fosfatidyletanolamin likevekten mot IF-tilstanden. DERETTER md simuleringer av transportørene i lipid bilayers identisk med nanodisker’ sammensetning spådd direkte interaksjoner mellom ladet fosfatidyletanolamin headgroup og en konservert cytoplasmatisk nettverk av ladede rester, stabilisere av staten (Doki et al ., 2013). Muterende ladede rester avskaffet effekten av fosfatidyletanolamin, noe som sterkt tyder på at spesifikke fosfatidyletanolamin-proteininteraksjoner kontrollerer transportørens indre likevekt. Denne studien er et sterkt eksempel på å kombinere eksperimentelle og beregningsmetoder for å identifisere subtile, men funksjonelt signifikante protein-lipid-interaksjoner.

Helix Slappe Av Under Transport: Studier Av LeuT

LeuT Er en prokaryotisk homolog av nevrotransmitter/Na+ symporters (NSS) familien, som inkluderer viktige narkotika mål som serotonin, dopamin, og noradrenalin transportører (Kristensen et al., 2011). LeuT ble grundig studert, og dets krystallografiske strukturer langs transportsyklusen er tilgjengelige (Focke et al., 2013). Disse strukturene foreslo at store strukturelle omarrangementer kreves under vekslende tilgang (Krishnamurthy Og Gouaux, 2012). Imidlertid er det konformasjonelle landskapet som tillater overgangen MELLOM HVIS og av stater fortsatt unnvikende og kontroversielt.

for å studere overgangen mellom forskjellige tilstander ble vaskemiddeloppløselig LeuT undersøkt under forhold som favoriserer IF eller av stater (Merkle et al., 2018). Overraskende viste MANGE peptider, hovedsakelig på den intracellulære siden AV transportøren, EX1 kinetikk. Dette er ganske uvanlig i foldede proteiner under innfødte forhold og anses å reflektere en lang levetid utfoldelse av sekundære strukturelementer. Basert på den romlige fordelingen av peptider som viser EX1 kinetikk, sammen med de tilgjengelige krystallografiske strukturer, ble det foreslått at spesifikke helikser gjennomgår delvis avvikling under vekslende tilgang, og at disse konformasjonsendringene også bidrar til substratfrigivelse. Denne studien fremhever den funksjonelle betydningen av sakte (sekunder tidsskala) konformasjonsendringer som kan løses godt VED HJELP AV HDX-MS, i motsetning til andre eksperimentelle eller beregningsmessige (F.eks.

Hydrogen-Deuterium Utveksling Massespektrometri Av Membranproteiner I Lipid Nanodisker

interaksjonene av membranproteiner med omgivende lipider kan dramatisk modulere deres funksjon (Vadas et al., 2017). Faktisk er aktiviteten til eukaryote nss-medlemmer betydelig avhengig av spesifikke lipid-protein-interaksjoner som modulerer proteindynamikken og dermed substratinteraksjoner (Divito Og Amara, 2009). Derfor, Adhikary et al. studerte LeuT rekonstituert i fosfolipid dobbeltlag nanodisker (Adhikary et al., 2017). Ved hjelp Av Denne tilnærmingen Ble LeuT undersøkt under forhold som favoriserer IF OG av konformasjoner. Sammenligning AV HDX-mønstrene mellom disse tilstandene viste spesifikke endringer i regioner som tidligere var involvert i transportsyklusen, noe som gjenspeiler funksjonelt signifikante strukturelle endringer. Interessant nok støttet HDX-MS-dataene, i samsvar med tidligere biofysiske og beregningsstudier, en mindre vinkel for den første transmembrane helixen I IF-konformasjonen sammenlignet med det som ble observert i krystallstrukturer. Denne forskjellen ble tilskrevet lipidmiljøet, siden krystallstrukturen ble oppnådd i vaskemiddel med liten mengde lipid. FOR å oppsummere GIR HDX-MS en fleksibel plattform for å studere membranproteiner i forskjellige hydrofobe miljøer og under forhold som favoriserer spesifikke konformasjonstilstander, uten behov for stedsspesifikk merking.

Ion Interaksjoner Med Flere Steder: Na+/Ca2+ Leren

NCX deltar i cellulær Ca2 + homeostase ved ekstrudering Ca2 + fra cellene mot sin elektrokjemiske gradient (Blaustein og Lederer, 1999). NCX-utvekslinger 3Na+: 1Ca2+, Hvor Na + Og Ca2 + transporteres i separate trinn(Khananshvili, 1990). Overraskende viste krystallstrukturen TIL NCX Fra Metanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) fire ionbindingssteder, samtidig okkupert av Tre Na+ – ioner på steder som kalles Sint, Smid, Sext og En Ca2 + – ion på et sted som kalles SCa (Liao et al., 2012). SIDEN denne bindingsmodusen var uforenlig med tidligere studier, BLE MD-simuleringer og ionfluxanalyser av mutanter utført, noe som tyder På At Na + – ioner opptar Sint, SCa og Sext, Mens Ca2 + opptar SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Dermed er Na+ og Ca2+ ioner bundet på en gjensidig eksklusiv måte langs transportsyklusen.

for å eksperimentelt etablere tildelingen av ionbindingssteder, sammenlignet vi apo-tilstanden Med Ionbundne tilstander Av NCX_Mj ved HJELP AV HDX-MS (Giladi et al ., 2016a; Giladi et al., 2017). Til tross for lav sekvensdekning inkluderte vår analyse 10 av 12 ionkoordinerende rester. Vi oppdaget En Na + – avhengig reduksjon i deuteriumopptak Ved Sint, SCa og Sext, men ikke Smid, mens i Nærvær Av Ca2+ ble reduksjonen i deuteriumopptak hovedsakelig observert Ved SCa. Dette stemmer overens med prognosene FRA MD-simuleringene og mutasjonsanalysene som forutså okkupasjonen Av Smid av et vannmolekyl, men Ikke Av Na + Eller Ca2 + i grunntilstanden (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Spesielt har etterfølgende krystallografiske studier validert våre bindingssteders oppdrag (Liao et al., 2016). DERMED bekreftet HDX-MS ionbindingsmodusen foreslått av beregnings-og funksjonelle studier.

Ion Selektivitet Av En Li+-Transport NCX Mutant

den mitokondrie Na+ / Ca2+ exchanger (NCLX) viser eksepsjonell ion selektivitet, utveksling Ca2+ med Enten Na+ Eller Li+, Mens NCXs ikke transportere Li+ (Palty et al., 2010). Selv om den fysiologiske relevansen av denne ionselektiviteten forblir forvirrende, er det bemerkelsesverdig at 9 (av 12) ionkoordinerende rester i NCLX skiller seg fra De I Ncx og andre medlemmer Av Ca2+/kation antiporter superfamilien. For å forstå hvordan disse forskjellene påvirker ionbindingsgjenkjenning og transport, utførte vi strukturbasert utskifting av ionkoordinerende rester i NCX_Mj for å etterligne nclx-bindingsstedene (Refaeli et al., 2016). Påfallende formidler den nyutviklede konstruksjonen (kalt NCLX_Mj) Na+ / Ca2 + Og Li + / Ca2 + med sammenlignbare Km-verdier (Refaeli et al., 2016).

Deretter søkte vi å avgjøre om ionbindingsstedene I NCLX_Mj minner om NCX_Mj (Giladi et al., 2019). HDX-MS analyser av ion-induserte konformasjonsendringer viste At SCa binder Na+, Li + eller Ca2+, mens en Eller flere Ekstra Na+ / Li + nettsteder Av NCLX_Mj er inkompatible med de opprinnelige Na+ nettstedene (Sext og Sint) tildelt NCX_Mj. Disse resultatene antydet At NCLX_Mj kan transportere ioner med en elektronøytral støkiometri på 2Na+: 1ca2 + eller 2Li+: 1Ca2+. I samsvar MED HDX-MS-dataene akselererer spenningsklemmen Na+ / Ca2 + valutakursene I NCX_Mj-rekonstituerte proteoliposomer (på grunn av en støkiometri på 3Na+:1Ca2+), mens Det ikke har noen merkbar effekt På Na+ / Ca2 + eller Li+/Ca2+ valutakurser I Nclx_mj (Giladi et al., 2019).

våre studier har vist NYTTEN AV HDX-MS i å identifisere og validere bindingssteder i iontransportører, hvor relativt små forskjeller i ion-induserte HRYVDX-signaler gir viktig informasjon om ion selektivitet og konformasjonsendringer som forekommer ved ionbinding på forskjellige steder. SÅLEDES, kombinert MED MD-simuleringer og røntgenkrystallografi, ER HDX-MS spesielt tiltalende for å belyse de strukturelle determinanter av ionselektivitet og ion-induserte konformasjonsendringer i iontransportsystemer som omfatter flere ionbindingssteder.

Konklusjoner

i løpet av de siste tiårene har strukturbiologi bidratt enormt til vår forståelse av membranproteinfunksjon, hovedsakelig ved å gi statiske øyeblikksbilder av diskrete tilstander i høy oppløsning. For å fullt ut dechiffrere struktur-funksjonsrelasjonene som ligger til grunn for den komplekse prosessen med løsstofftransport, har et økende antall eksperimentelle og beregningsmetoder blitt utviklet for å bygge bro over gapet mellom disse statiske øyeblikksbildene og bestemme de underliggende konformasjonelle landskapene. HDX-MS brukes i økende grad til å studere intakte membranproteiner under ulike nærfødte forhold, og gir nye muligheter til å studere membran-proteininteraksjoner, substratgjenkjenning og transportrelaterte konformasjonsoverganger. Fremtidig utvikling i instrumentering og dataanalyse automatisering kan tillate bruk AV HDX-MS i høy gjennomstrømning, fullt utnytte sin potensielle bruk i grunnforskning og biomedisinske applikasjoner som narkotika design.

Forfatterbidrag

MG OG DK gjennomgikk litteraturen og skrev manuskriptet.

Finansiering

dette arbeidet ble støttet Av Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) og Av Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Økonomisk støtte Fra Shmuel Shalit award TIL DK er takknemlig anerkjent.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.