Eksperimentell
Merking Av RuBisCo:
Aedans(454): donor F(58): akseptor
Bindende Studier:
Vilkår:
ADP bullet: GroEL kompleks bundet Til GroES og ADP
ApoGroEL: Bare GroEL comlex (Brukt i tidligere bindende studier av rubisco substrat)
Lin et al. bestemt at:
1. Det var en forskjell I FRET på substratbinding til transringen AV ADP bullet vs apoGroEL ring.
– Dette var tydelig ved slukking av donorfluorescens (B.)
– dette indikerte en forskjell i konformasjon av proteinsubstratet.
 |
2. Fant en «passiv» utfoldelse av substratproteiner bundet til apogroelringen.
– denne utfoldelsen skjedde imidlertid mye langsommere Enn Groels funksjonelle reaksjonssyklus.
3. Det er mindre «passiv» utfoldelse av substratet bundet TIL ADP bullet trans-ring.
– Bekreftet dette med protease fordøyelsen studier.
– dette Er imidlertid det mer fysiologisk relevante komplekset.
– Så er dette et maksimalt effektivt nivå, eller bare det første trinnet i reaksjonssyklusen?
for å teste den fysiologiske relevansen, la DE ATP TIL ADP-Kulereaksjonen, og overvåket FRET
 |
ved tillegg AV ATP fant DE: – en innledende rask, tvungen konformasjon ekspansjon av substratet – og deretter en langsommere komprimeringsfase – Tydelig I Figur b |
 |
-figur c indikerer at kinetikken i komprimeringsfasen Er Avhengig av groes-konsentrasjon, noe som betyr at den er avhengig av
denekvestrasjonsmekanisme av komplekset.
– mens ekspansjonsfasen er uavhengig Av GroES konsentrasjon.
Konkluderte med at det er to faser Av Utfoldelse:
– Langsom passiv utfoldelse på grunn av substrat binde til trans ring Av GroEL Kammer (fra første bindende eksperiment)
– Rask, ATP drevet utfoldelse på grunn av konformasjon endring Av GroEL kammeret.
Rapid unfolding er Ikke GroES avhengig:
– et overskudd av en single-ringed GroEL variant, SR1 ble brukt som En GroES felle.SR1 er ikke i stand til å binde substrat og katalysere en utfoldende reaksjon, men er i stand Til å binde Og sekvestrere GroES for å bestemme avhengigheten av reaksjonen på sekvestrering av substratet.
– de bestemte seg for at den raske utfoldingen monitered AV FRET forekom uten GroES cap tilstede, og den påfølgende komprimeringsfasen didnot.
– dette indikerer at den raske ekspansjonsfasen er avhengig av konformasjonsendring Av GroEL indusert AV ATP-binding.
Så .. er utfoldingen av substratet nødvendig for Produktiv folding?
– Er Dette et viktig skritt, og viktig Å GroEL/GroES foldemekanisme?
– de fant at brøkdelen Av ikke-innfødt RuBisCo som kommer fram i den innfødte staten er proporsjonal med omfanget av utfolding.
– for å undersøke dette ønsket de å måle den langsomme , passive utfoldingen av substratet på Grunn Av Groelbinding alene(ikke ATP
avhengig)
-de brukte IGJEN SR1-binding til substrat, denne gangen ikke som atrap, men som et passivt utfoldende bindingssted for substratet.
– Inkubasjonstid MED SR1 er korrelert til mengden av utfolding, siden utfoldingen skyldes bare binding av substratet.
– de bestemte seg for at det er en sammenheng mellom mengden utfolding til innfødt protein.
– så tvungen utfoldelse Av GroEL / GroES er en effektiv måte å fremme utfoldingsmekanismen
som trengs for riktig proteinfolding.
 |
 |
 |
 |