Humane T-celler uttrykker CD25 og Foxp3 ved aktivering og viser effektor/minnefenotyper uten noen regulatorisk/suppressorfunksjon

Aktivering Av T-celler induserer ekspresjon AV CD25 og Foxp3 assosiert med effektor og minnefenotypedifferensiering

PBMC ble stimulert med bryostatin-1 (5 nM) og ionomycin (f.eks. 1 Μ) (B/i) i nærvær av 80 u/ml il-2 (peprotech) Til 16 t. B / I-aktivering etterligner intracellulære signaler som resulterer i t-celleaktivering ved å øke henholdsvis proteinkinase C-aktivitet og intracellulært kalsium . Celler ble vasket tre ganger og dyrket ved 106 celler / mL i komplett medium med 40 E / mL IL-2 (Peprotech) i 3 dager og ekspresjon Av Foxp3 ble bestemt ved bruk av flowcytometrianalyse. Ekspresjon Av FoxP3 ble også bestemt på nyisolerte T-celler på dag 0. Som vist I Fig. 1a (topp panel), TILSTEDEVÆRELSE AV IL-2 alene i 3 dager økte ikke markant ekspresjonen Av Foxp3 eller CD25 over baseline nivåer på dag 0 (Fig . 1C). B / I-aktiveringen induserte Imidlertid Foxp3-og CD25-uttrykk i CD4+ – og CD8 + T-celler (Fig. 1a, midtre panel). VED b / i-aktivering ble CD4+CD25+Foxp3+ T-celler økt fra 1% til 23% (P = 0,016) og CD8+CD25+Foxp3+ T-celler økt fra 0,6% til 9% (P = 0,013). Forlengelse av kultur i NÆRVÆR AV IL-2 i 6 dager uten ytterligere stimulering beholdt CD4 + CD25 + Foxp3 + T-celler over baseline nivåene i uaktiverte T-celler (1% vs. 7%; P = 0,031) MENS CD8 + CD25 + Foxp3 + T-celler falt til baseline nivåer (0,6%). Disse resultatene tyder på at aktiveringsindusert uttrykk For Foxp3 I CD4+CD25+ t-celler er mer stabil enn I CD8 + CD25 + T-celler. Absolutt Antall t-celler økte 3 og 6 dager Etter b / I stimulering og ekspansjon i nærvær AV IL-2 (Fig. 1B). Aktivering Av T-celler ved hjelp av anti-CD3 / CD28 Abs i 3 dager ga lignende resultater som For b / I-aktivering ved å øke CD4 + CD25 + FoxP3 + T-celler fra 0,4% til 8,7% (Fig . 1C). Fenotypeanalyser av T-celler viste CD44 + effektor og CD44 + CD62L + minnefenotyper før og 6 dager etter B/I-aktiveringen (Fig . 1d, topp panel). Mens effektor CD4+ og CD8 + t-celler ble redusert etter aktivering (henholdsvis 18% til 9% og 21% til 13%), ble minne CD4+ OG CD8+ T-celler økt (henholdsvis 82% til 91% og 79% til 87%). VED b / I-aktivering viste CD4+ T-celler en 6 ganger økning Av FoxP3-uttrykk i CD44+, CD62L+ fenotyper (CD44+: 2,6% til 15%; CD62L+: 2% til 12%). I tillegg viste BÅDE CD4+ OG CD8 + t-celler Foxp3høy uttrykk etter aktivering sammenlignet Med FoxP3low-uttrykk på dag 0 (Fig . 1d, midtre og nedre paneler). ALLE CD4 + Foxp3 + t-celler uttrykte CD44, hvorav 80% uttrykte OGSÅ CD62L (Fig. 1D, midtpanel, langt til høyre). Disse dataene viser at 20% AV CD4 + Foxp3 + T-celler er effektor og 80% er minnefenotyper. EN lignende fenotypisk trend ble påvist FOR CD8 + Foxp3 + T-celler, som viste 100% CD44 + hvorav 67% VAR CD62L + T-celler (Fig . 1D, nederste panel, helt til høyre). Disse resultatene viser at 33% AV CD8 + Foxp3 + T-celler er effektor og 67% er minnefenotyper. Data presentert I Figs. 1A-D antyder at økt ekspresjon Av FoxP3high i effektor T-celler skyldtes celledifferensiering i stedet for celleproliferasjon, fordi relativ prosent AV CD44 + CD62L-effektor T-celler ble redusert etter b / I-aktivering. Lignende mekanisme kan eksistere i minne T-celler på grunn Av uttrykket Av FoxP3high etter aktivering sammenlignet Med FoxP3low på dag 0.

Aktiveringsindusert FoxP3-uttrykk I CD4+ T-celler unnlater å formidle regulatorisk funksjon in vitro

T-celler ble merket MED CFSE og stimulert med ANTI-CD3 (1 ug/ml) Og ANTI-CD28 (1 ug/ml) Abs i nærvær eller fravær Av DEN b/i-aktiverte CD4+CD25+foxp3+ t-celler (2:1 og 20:1 responder:suppressorforhold) i 3 dager. Flowcytometrianalyse viste lignende proliferasjonsrater av gated CD8 + T-celler i fravær eller nærvær av induserbare FoxP3+ T-celler (Fig. 2A, 60% vs. 61% og 65%). CD3 / CD28-aktiveringen induserte Også FoxP3-uttrykk i responder CD4 + T-celler. Gated CD4 + FpxP3 + T-celler viste også 70-75% proliferasjon ved aktivering (Fig. 2A). Analyse av t-celleapoptose viste tilsvarende forekomst av apoptose i responder T-celler i fravær eller nærvær AV CD4 + FoxP3 + T-celler (Fig. 2B, 57% vs. 57 og 59%). Flertallet Av DE B / I-aktiverte CD4+FoxP3 + T-cellene (74-76%) ble funnet å være apoptotiske under ANTI-CD3/CD28-aktivering i ko-kultur med responder T-celler.

Allogen aktivering Av T-celler under MLR induserer Foxp3-uttrykk i CD4+CD25+ t-celler assosiert med effektor / minnefenotype

vi utførte en 8-dagers ALLOGEN MLR for å avgjøre om induksjon Av Foxp3-uttrykk i T-celler var stabil under MLR, og om et slikt indusert Foxp3 + – uttrykk kan hemme t-celleproliferasjon. Responder-og stimulatorceller ble hentet fra forskjellige friske donorer. Stimulatorceller ble bestrålt (5000 rad) og dyrket med responderceller i 8 dager i nærvær av 10 µ BrdU (BD Pharmingen). Cellene ble deretter farget med relevant Abs og utsatt for flowcytometrianalyse. Som vist I Fig. 3A (topppanel) 86% AV CD4 + CD25 + T-celler og 93% AV CD8+CD25+ T-celler viste BrdU inkorporering som følge av celleproliferasjon. Ingen proliferasjon ble påvist i responder-eller stimulatorcellene alene (data ikke vist). Slik allogen proliferasjon fant sted i nærvær Av Et Aktiveringsindusert Foxp3-uttrykk I CD4 + T-celler, slik at 8% AV CD4 + T-cellene var CD25 + Foxp3+ (Fig . 3a, nedre panel). CD8 + CD25 + t-celler, derimot, viste ikke stabilt uttrykk For Foxp3. Disse resultatene er i samsvar med vår observasjon I Fig. 1 viser at uttrykket Av Foxp3 I CD4 + T-celler er mer stabilt enn DET I CD8 + T-celler 6-8 dager etter t-celleaktivering. I tidligere rapporter ble suppressive analyser in vitro utført i nærvær AV høye prosenter AV CD4 + CD25 + T-celler (Tregs) til responderceller, for å bestemme suppressiv funksjon på t-celleaktivering og proliferasjon. Slike kunstige økninger i forholdet MELLOM CD4 + CD25 + t-celler og responderceller vil redusere in vivo validitet av observasjonen. Frekvensen AV CD4 + CD25 + Foxp3 + T-celler indusert under MLR var 8% som anses å være innenfor det fysiologisk relevante området som rapportert av andre grupper . Frekvensen av naturlig Forekommende Tregs i mus er også rundt dette området, men har regulatoriske effekter for hemming av autoimmunitet. Hvis Foxp3-uttrykte CD4 + T-celler hadde noen regulatorisk funksjon, bør den ha hemmet celleproliferasjon under kulturen in vitro. I likhet Med b / I-indusert t-celleaktivering inkluderte T – cellefenotyper I EN MLR CD44+ effektor (16%) OG CD44 + CD62L + minne T-celler (84%) (Fig. 3B). Igjen uttrykte ALLE CD4 + Foxp3 + T-celler CD44, hvorav 90% også uttrykte CD62L(Fig . 2B). Disse dataene viser at 10% AV CD4 + Foxp3 + T-celler er effektor og 90% er minnefenotyper. EN lignende fenotypisk trend ble påvist FOR CD8 + Foxp3 + T-celler, som viste 100% CD44 + hvorav 76% VAR CD62L + T-celler. Disse resultatene viser at 24% AV CD8 + Foxp3 + T-celler er effektor og 76% er minnefenotyper. Mangel på regulatorisk funksjon i Disse Foxp3 + T-cellene kan skyldes effektor / minnefenotype siden det er rapportert at ekspresjon Av Foxp3 i Humane minne T-celler resulterte i redusert suppressoraktivitet . I tillegg gir Treg type 1 (Tr1) celler suppressorfunksjon i fravær Av FoxP3-uttrykk . Gitt Rollen Som Foxp3 som master regulator Av Treg avstamning engasjement og vedlikehold i mus, det ser ikke ut til å ha en slik bona fide regulatorisk funksjon For Treg avstamning engasjement i humane T-celler.