interaktomene TIL POU5F1-og SOX2-forsterkere i humane embryonale stamceller

Identifikasjon AV POU5F1-og SOX2-forsterkerinteraktomer

de antatte POU5F1-og SOX2-forsterkerregionene er evolusjonsbevart på tvers av virveldyr (44 arter), med aktive forsterkersignaturer definert av epigenetiske merker som p300 histonacetyltransferase OG H3K27AC, men ikke h3k27me3 I Hescs7 ( Supplerende fig. 1A). Vi brukte 4c teknikken for å identifisere de samvirkende partnerne til» agn » antatte forsterkere AV POU5F1 OG SOX2 i den pluripotente h9 cellelinjen. Kort sagt ble cellene festet til krysskromosomer i nærhet. Kromosomene ble deretter fragmentert ved sonikering. Interagerende kromatinfragmenter ble ligert og DNA-stykkene ble renset. Genomiske regioner som interagerer med » agn » ble deretter forsterket AV nestet PCR (Supplerende Fig. 1b, Utfyllende Tabell 1). Vi designet inverse PCR-primere for å målrette antatte forsterkere AV POU5F1-og SOX2-genene. Det konstruerte 4c-biblioteket kunne visualiseres VED DNA-elektroforese, mens kontrollen uten ligering viste nesten ingen PCR-produkter(Supplerende Fig. 1B), som indikerer AT 4c-biblioteket ble forsterket fra ligeringsprodukter.Vi utførte neste generasjons DNA-sekvensering ved Hjelp Av En Illumina HiSeq-sequencer og klassifiserte de identifiserte 4c-interaksjonene som enten proksimale eller distale interaksjoner (Se Metoder). Distale interaksjoner inkluderer interkromosomale interaksjoner og intrakromosomale interaksjoner over genomiske avstander større enn 20 kb, mens proksimale interaksjoner dekker intrakromosomale regioner med genomiske avstander mellom 300 bp og 20 kb. I samsvar med resultatene FRA 3c-baserte studier, utgjør vår distale interaksjon bare en liten del av de totale interaksjonene, omtrent 10% ~ 20% FOR 4c-bibliotekene (Supplerende Tabell 2). Vi brukte to forskjellige grupper Av H9 celler til å konstruere 4c biblioteker FOR POU5F1 OG SOX2 uavhengig for neste generasjons sekvensering. DE to replikatene AV POU5F1 og SOX2 distale interaksjoner overlapper med henholdsvis 35% og 25%. Dette er i samsvar med moderat overlapping observert i biologiske replikater AV CTCF-medierte kromatininteraktomer i mus ES-celler27 og kan gjenspeile mangfoldet og dynamikken i enhancer-interaksjoner, ligeringseffektivitet, kompleksitet AV PCR-forsterkning samt sekvenseringsdybde. For å filtrere ut interaksjoner som sannsynligvis skyldes stokastiske effekter, brukte vi en falsk oppdagelsesrate (fdr)-basert statistisk modell for å identifisere de berikede samspillende domenene over hele genomet. Vi fusjonerte videre de berikede samspillende domenene som overlapper mellom de biologiske replikatene som høy konfidens hyppige samspillende domener. Totalt ble det identifisert 23 og 9 hyppige interaksjonsdomener med høy konfidens for HENHOLDSVIS POU5F1-og SOX2-interaktomene (Figur 1, Supplerende Tabell 3, 4), og de fleste av dem er interkromosomale interaksjoner som involverer genrike regioner, tilsvarende e4C-resultatene20.

interactomes AV POU5F1 OG SOX2 enhancers overlapper med tidlige DNA replikasjon domener, men ikke med heterochromatic regioner

vi undersøkte neste om POU5F1 og SOX2 enhancer interaksjonsdomener (størrelse fra 1 Mb til 4 Mb, Supplerende Tabell 3, 4) har noen unike epigenetiske egenskaper. Som Ryba et al. showed28, dna replikasjon timing korrelerer med romlig nærhet av kromatin målt Ved Hi-C analyse, noe som tyder på at tidlig OG sen DNA replikasjon forekommer i romlig distinkte rom i kjernen. VI la merke TIL AT POU5F1 og SOX2 gen loci er innenfor tidlige DNA-replikasjonsdomener i hESCs og lurte på om deres interagerende domener har en lignende DNA-replikasjonstiming. SOM vist I Figur 2a overlapper POU5F1 OG SOX2 enhancer interagerende domener hovedsakelig med TIDLIGE DNA-replikasjonsdomener i hESCs. Fordelingen av analyserte replikasjonstidsverdier innenfor de genomiske områdene rundt DE identifiserte POU5F1 og SOX2 enhancer-interaksjonsstedene (50 kb-området) viser et skifte mot positive verdier sammenlignet med genom-brede arrayverdier (P < 2.2 × 10-16 for begge, ved Uparet Wilcoxon rang-sum test; Figur 2b ). Denne observasjonen avslørte en interessant epigenetisk funksjon, at høyere ordens strukturer rundt POU5F1 og SOX2 forsterkere har synkronisert DNA-replikasjonstiming. Da TIDLIGE DNA-replikasjonsdomener har blitt koblet til aktiv gentranskripsjon i hESCs28, er det sannsynlig at interaksjonene MELLOM POU5F1-og SOX2-forsterkere med de identifiserte distale regionene har funksjonell betydning. Denne observasjonen er i samsvar med DET VI har sett I POU5F1 enhancer interactome i mus ES-celler (data ikke vist). Også avslørt I Figur 2a, POU5F1 OG SOX2 samvirkende domener ikke overlapper med heterokromatiske regioner merket med sterke H3K9me3 signaler i hESCs29, noe som tyder på at interaktomer er innenfor en aktiv del av genomet i form av genregulering. I tillegg utforsket vi et potensielt forhold til De nukleare lamina-tilknyttede domenene (LADs) av humane kromosomer30, men observerte ikke noen sammenheng, muligens på grunn av At Guttene ble bestemt i humane fibroblaster.

enhancer-interaktomene er tilstøtende til transkripsjonsstartsteder og har aktive epigenetiske egenskaper

for å utforske korrelasjonen MELLOM POU5F1 og SOX2 enhancer-interaktomer med annoterte genplasseringer, analyserte vi fordelingen av den genomiske avstanden til enhancer-interaksjonsstedene til nærmeste gentranskripsjonsstartsted (Tss) ( Figur 3a ). Kjernetetthetsplottene til BÅDE POU5F1 og SOX2 enhancer-interagerende nettsteder viser tydelig en skarp topp sentrert på TSS. Sammenlignet med distribusjonstoppen av tilfeldig simulerte steder i hele genomet, er toppene observert i enhancer-interaktomene signifikant høyere innenfor et smalt vindu rundt TSS (P = 0,0018, p = 0,0047, Henholdsvis Kolmogorov-Smirnov test). Berikelse av de samspillende områdene rundt TSS antyder AT POU5F1 og SOX2-forsterkere foretrekker å interagere med genomiske regioner som inneholder gener. Vi undersøkte videre distribusjonen AV POU5F1 OG SOX2 enhancer-interagerende steder på forskjellige genomiske regioner31. Vist I Figur 3B er genpromotor-sekvenser en av de berikede områdene for BÅDE POU5F1 og SOX2 enhancer-interaktomene. I tillegg reduseres brøkdelen av distale intergeniske regioner konsekvent for de to interaktomene. Derfor antyder vår observasjon at den høyere ordens kromosomstruktur som omgir de aktive forsterkerne, kan være direkte involvert i genregulering. Også bemerket, når tilfeldige steder i de tidlige DNA-replikasjonsområdene (se Metoder for detaljer) er valgt for å sammenligne avstandsfordeling med TSS, ER POU5F1-OG SOX2-interaktomene fortsatt mer beriket rundt TSS, selv om det ikke er statistisk signifikant (P = 0,390, 1 P = 0,2098, Henholdsvis Kolmogorov-Smirnov-testen, Supplerende Fig. 2 ).

Histonmodifisering er kjent for å være involvert i transkripsjonsregulering ved dekondensering av kompakte kromatinstrukturer for transkripsjonsfaktorbinding. 3c–Baserte genom-brede interaktomstudier har identifisert aktive og inaktive kromatinrom i kjernen, med aktive rom beriket med histonmerker som aktiverer gentranskripsjon, For Eksempel H3K9ac32. Vi spurte derfor om aktive forsterkere AV POU5F1 og SOX2 selektivt interagerer med distale regioner som viser aktiv gentranskripsjon. ChIP-Seq tag profiler Av H3K27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 Og H3K36me3 I H1 ES celle line33 ble brukt for å analysere histon mønstre assosiert med interactomes. ChIP-Seq-koder rundt enhancer-interaksjonsstedene ble talt og normalisert 34 og visualisert som boxplot. SOM nevnt HAR POU5F1 og SOX2 interaktomer høyere intensitetsprofiler Av H3K4me1, H3K4me2 Og H4K20me1, som er merker for genaktiv regulering (Figur 4a). Sammenlignet med de tilfeldige stedene i TIDLIGE DNA-replikasjonsområder, er de undersøkte histonmerkene generelt mer beriket I POU5F1 interactome enn I SOX2 interactome, Med H3K4me1 og H3K9ac er de mest signifikant beriket i POU5F1 interactome (P < 2.2 hryvnias 10-16 for begge merkene, Uparet Wilcoxon rang-sum test). Interessant Nok er Polycomb-mediert gendeaktiveringsmerke H3K36me335 ikke beriket i enten interaktom (henholdsvis p = 0,485, p = 0,922). Vi undersøkte også forholdet MELLOM POU5F1 OG SOX2 enhancer interactomes med 5-hydroksymetylcytosin (5-hmC) steder i genomet. Som en tidligere studie viste, er genomiske 5-hmC-steder beriket ved aktive forsterkere i hESCs36. FORDI POU5F1 OG SOX2 upstream enhancers er tilstøtende til 5-hmC nettsteder (innen 5 kb), spurte vi om enhancer interactomes er også beriket med 5-hmC nettsteder. Vist I Figur 4B er 5-hmC-lokaliteter anriket i nærheten AV POU5F1-og SOX2-interaktomer sammenlignet med tilfeldige lokaliteter i tidlige DNA-replikasjonsområder(p< 2,2 × 10-16, p = 0,047, Henholdsvis Kolmogorov-Smirnov-test). Således har de to forsterkerinteraktomene i hESCs epigenetiske egenskaper av aktive forsterkere, noe som kan lette aktiv regulering av gentranskripsjon.

(a) sammenligning av rpkm-verdier for de samspillende genene (gener med en tss ≤ 10 kb fra de samspillende stedene) med alle humane ensembl-gener (gjennomsnittlige rpkm-verdier fra replikere rna-seq-data i kode ble brukt). (B) Differensialuttrykk ble analysert for å sammenligne interaktomgener i hESCs og føtale lungefibroblaster.

Transkripsjonsstatus FOR POU5F1 og SOX2 enhancer interagerende gener

for å forstå transkripsjonsstatusen til gener assosiert med POU5F1 og SOX2 enhancers, analyserte VI rna-Seq transkriptome data i hESCs og føtale lungefibroblasts37, med fokus på gener som har en tss innenfor 10 kb av enhancer–interagerende nettsteder. I hESCs er ekspresjonen AV POU5F1–og SOX2-forsterkerinteraksjonsgener signifikant høyere enn for alle gener i hESCs (P = 7,5 × 10-6 og P = 1.2 × 10-6, henholdsvis ved uparet Wilcoxon rank-sum test; Figur 5a), som indikerer at interaktomene er beriket med aktivt transkriberte gener. Dermed kan aktive POU5F1-og SOX2-forsterkere være involvert i mediering av transkripsjon av de tilknyttede distale gener. Rna-Seq transkriptomanalyse viste også at genene som opprinnelig var assosiert med aktive POU5F1-og SOX2-forsterkere i hESCs, er nedregulert i differensierte lungefibroblaster (P = 1,2 × 10-5 og p = 0,013, henholdsvis ved parret Wilcoxon rank-sum-test; Figur 5b). Disse resultatene indikerer at forsterkerne av disse to stemness – relaterte gener interagerer med en gruppe gener som er sterkt uttrykt i hESCs, men undertrykt i fibroblaster.

Distale gener assosiert MED POU5F1 enhancer er involvert i regulatoriske kretser av pluripotency

for å undersøke om POU5F1 og SOX2 enhancer-interagerende gener bidrar til selvfornyelse og pluripotency av hESCs, analyserte vi en data fra en genom-wide RNA interferens skjerm ved hjelp AV EN POU5F1 promoter reporter analyse i hESCs38. Interferens av transgen POU5F1-GFP uttrykk er kvantifisert Med Fav verdier som reflekterer GFP fluorescens intensitet, som representerer tilbøyelighet til å være stemness-relatert (Figur 6a). I forhold til alle genene som ble screenet, VISER POU5F1 enhancer–interagerende gener (gener nærmest de interagerende nettstedene, med genomisk avstand fra TSS til de interagerende nettstedene mindre enn 10 kb) en trend med avtagende Fav-verdier, men statistisk ikke signifikant(P = 0,08, uparget Wilcoxon rank-sum test). For SOX2–målrettede gener er Fav-verdiene imidlertid lik alle genene som screenes (P = 0.98, unpaired Wilcoxon rang-sum test). Derfor, basert på disse dataene, synes gener I POU5F1-interaktomet å være viktigere for stamcellepluripotens enn gener i SOX2-interaktomet.

Gene ontology analysis39 av 39 POU5F1-interagerende gener og 20 SOX2–interagerende gener viste at en betydelig del av dem skulle være involvert i transkripsjonell regulering (henholdsvis 30,8% og 35,0% FOR POU5F1-og SOX2-interaktomene; Supplerende Tabell 5, 6) og distribuert til 8 og 4 forskjellige interagerende domener i HENHOLDSVIS POU5F1-og SOX2-interaktomene, med ikke mer enn 3 gener i ett interagerende domene. Differensial ekspresjonsanalyse av disse transkripsjonsregulatorene i hESCs og føtale lungefibroblaster avslørte 9 av DE I POU5F1-interaktomet (11 av 12 identifiserte transkripsjonsregulatorer har RNA-Seq-data) for å ha høyere uttrykk i hESCs ( Figur 6b ), noe som tyder på aktive roller for disse genene i pluripotency regulatory network i hESCs. For de transkripsjonelle regulatorene I SOX2 interactome viste 3 av 5 økt uttrykk i hESCs. DERFOR KAN POU5F1 enhancer interactome spille en større rolle i stamcellepluripotens enn SOX2 enhancer interactome.

Flere bindingssteder for transkripsjonsfaktor er beriket MED POU5F1 og SOX2 enhancer–interaktomer

bindinger For Transkripsjonsfaktor er en av egenskapene som forsterkere besitter, og Det kan legge til rette for langtrekkende kromatin–kromatin-interaksjoner mellom forsterkeren og distale gener. POU5F1 OG SOX2 antatte forsterkere er kjente hot spots for forening av flere DNA-bindende proteiner i hESCs. For å forstå om visse transkripsjonsfaktorer er beriket I POU5F1 og SOX2 enhancer-interagerende regioner, analyserte vi systematisk ChIP-Seq-profiler av 32 DNA-bindende proteiner i hESCs (se Metoder). Normalisert ChIP-Seq tag teller rundt midten AV 4c samspill områder ble beregnet og visualisert ved hjelp boxplot (Figur 7A ). Som en kontroll ble tellingene rundt midten av de tilfeldige stedene i de tidlige DNA-replikasjonsområdene også beregnet. Statistisk analyse identifisert atf3 -, CTCF -, GABPA -, JUND -, NANOG -, RAD21-og YY1-steder var de mest berikede proteinene i begge enhancer-interaktomene sammenlignet med kontrollen (P < 0,01, uparget Wilcox rank-sum-test). Pluripotensrelatert transkripsjonsfaktor OCT4 er imidlertid ikke beriket I ENTEN POU5F1 eller SOX2 interactome. DERFOR er ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 OG YY1 de karakteristiske proteinene I POU5F1 og SOX2 enhancer-interaktomer i hESCs, og deres tilstedeværelse kan være funksjonelt viktig.

RAD21 er potensielt i kompleks med andre transkripsjonsfaktorer for å mediere enhancer-interaktomene

SOM vist I Figur 7A , ER RAD21 ET av de berikede proteinene identifisert I POU5F1 og SOX2 enhancer-interaktomer i hESCs. RAD21 er en del av et kohesjonskompleks kjent som EN DNA-kjede tverrbinker. Cohesin er vist å mediere looping Av Pou5f1 distal enhancer med Pou5f1 genpromotor I mus ES-celler40. I samsvar Med en tidligere rapport Som Rad21 samarbeider Med Ctcf og andre transkripsjonsfaktorer i å opprettholde mus ES celle identity40, RAD21 steder i BÅDE POU5F1 OG SOX2 interactomes i hESCs er co-okkupert av transkripsjonsfaktorer. Aggregering tomter tydelig illustrere peak signaler AV atf3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG OG YY1 bindende profiler i sentrum AV RAD21 steder I POU5F1 OG SOX2 interactomes (Figur 7B). Knockdown Av Gabpa i mus ES celler er kjent for å redusere Oct3 / 4 uttrykk, mens overuttrykk Av Gabpa opprettholder uttrykk For Oct3 / 4 selv uten LIF i mus ES celle culture41. I en genom–bred siRNA-skjerm i hESCs38 reduserte knockdown av de fleste berikede proteiner, SOM RAD21, CTCF, GABPA, JUND, NANOG OG YY1, signifikant uttrykket av en transgen POU5F1-promotor knyttet til EN gfp reporter, med Fav-verdier av -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, henholdsvis (innenfor topp 25% av alle genene screenet). FOR å forstå kromatin–kromatininteraksjonene, brukte VI DNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for å visualisere ko-lokalisering av to genomiske loci på enkeltcellenivå. Rarg-genet locus på kromosom 12 er identifisert I POU5F1 interactome i hESCs. RARG ble nylig vist å spille en svært viktig rolle i pluripotency og kan forbedre ips-celleinduksjon med to størrelser42. Et annet locus på kromosom 12 som ikke er en DEL AV POU5F1 interactome ble brukt som en kontroll. Ko-lokalisering frekvens mellom RARG locus (chr12: 51751589-51956291) OG POU5F1 locus (chr6: 31169844-31340561) ble funnet å være 1,67 ganger høyere enn frekvensen mellom kontroll locus (chr12: 80380971-80564119) OG POU5F1 locus (9,35% versus 5,61%, P < 0,05, SUPPLERENDE FIG. 3A ). Den høyere kontaktfrekvensen mellom RARG og POU5F1 loci er i samsvar med våre sekvenseringsdata og antyder at mer stabile interaksjoner dannes mellom de to loci. Undersøkelse AV RARG og kontroll loci ( Supplerende Fig. 3B) viste at DET er FLERE RAD21 og andre transkripsjonsfaktorbindingssteder i RARG-lokus med hyppig ko-lokalisering. Sammentreff av kromosominteraksjonsfrekvens med RAD21-holdige bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer antyder AT RAD21 kan samarbeide med andre transkripsjonsfaktorer for å organisere langtrekkende kromatin-kromatininteraksjoner. DERMED VIL RAD21, sammen med flere transkripsjonsfaktorer, sannsynligvis bidra til høyere orden kromosomal struktur rundt POU5F1 og SOX2 forsterkere i hESCs som en del av et pluripotency nettverk. Imidlertid er det nødvendig med flere molekylære studier for å bekrefte denne hypotesen avledet FRA 4C-Seq-studien.