4.3 BBB-krysset bsabs konstruert med single-domene antistoffer
sdAbs er små (15 kDa), monomere antigen-bindende fragmenter av antistoffer som gir ulike fordeler fremfor andre antistoff fragmenter som «byggesteiner» for bsAbs. De forekommer i naturen som antigenbindende del av tungkjede antistoffer i kamelidarter (kalt VHH) og bruskfisk (kalt VNAR) eller kan genereres fra konvensjonelle Igger ved å oppnå eller konstruere monomere, stabile VH-eller VL-domener (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Gü, Griffiths, Jones, & Vinter, 1989). sdAbs er svært stabile og kompakte, og de kan få tilgang til innfelte epitoper i proteiner, som reseptorhulrom eller de aktive stedene for enzymer, som ofte er «skjult» fra konvensjonelle Igger og kan oppnå målbindingsaffiniteter som er sammenlignbare med konvensjonelle antistoffer (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Disse monomere antigenbindende enhetene parres ikke med lette kjeder, noe som gjør dem til gode byggeklosser for heterodimerized bsAbs, da de unngår vanskeligheter med feil lettkjedeparing (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimere bsAbs kan opprettes med en eller begge «armer» som sdAb, sistnevnte er lik i struktur til camelid tungkjedede antistoffer (Fig. 3E). sdAbs kan også brukes i forskjellige mono -, bi – eller tetravalente fusjoner med konvensjonelle terapeutiske antistoffer Eller Fabs (Fig. 3E), som vanligvis resulterer i mindre, mindre komplekse molekyler, sammenlignet med de som genereres med scfver eller Fabs som byggesteiner, som pleier å være biofysisk veloppdragen og lett å produsere (Holliger & Hudson, 2005). Humanisering Av VHHs samt prosjektering av sdAbs er godt beskrevet, slik at det lett kan generere menneskelige (ized) sdAbs med optimal målaffinitet og eksepsjonelle biofysiske egenskaper (Vincke et al., 2009).
for å evaluere potensiell bruk av camelid VHH FC5 som BBB-bærer innen bispesifikke cns-målrettede antistoffer, ble monovalente og bivalente fusjoner (N – og C-terminus) AV FC5 med human Fc designet og evaluert in vitro og in vivo (Farrington et al ., 2014). Tilsynelatende bindingsaffinitet (kdapp) til rotte BEC for den bivalente fc5fc-fusjonen var 75 nM, mens monovalent fc5fc-binding var i mikromolarområdet. Analysene av tilsynelatende transmigrasjonsrater (Papp) på tvers av EN IN vitro BBB-modell, tilsynelatende CNS – eksponering avledet fra serum/CSF farmakokinetikk av systemisk administrerte antistoffkonstruksjoner og farmakologiske responser fremkalt av kjemisk konjugerte BBB-ugjennomtrengelige nevroaktive peptider i hargreaves smertemodell, ga bevis på forbedret BBB-transport av disse store (75 kDa) antistoffmolekylene mediert AV FC5: (1) In vitro Papp-verdier var ~ 200 cm/min for både mono-og bivalente N-terminale Fc-fusjonsmolekyler (Fcf). fc5fc) sammenlignet med 4-8 Cm/min for kontroll vhh a20.1fc-eller EG2Fc-fusjoner; (2) DEN tilsynelatende cns-eksponeringen Av fc5fc–fusjonen var 30 ganger høyere sammenlignet med kontrolldomene antistoff-Fc–fusjoner; (3) systemisk farmakologisk potens Av fc5fc-konjugater med nevropeptider dalargin eller galanin i hargreaves inflammatoriske smertemodell var opptil 60 ganger høyere sammenlignet med monomere FC5-nevropeptidkonjugater. Dette resultatet ble tilskrevet den lange sirkulasjonshalveringstiden (~96 h) Av FC5Fc– sammenlignet MED fc5-nevropeptidkonjugater; (4) ulike kontroll vhh-Fc nevropeptidkonjugater viste ingen systemisk effekt; (5) fusjon AV FC5 Til C-terminus Av Fc resulterte i svekket BBB-krysset kapasitet. I motsetning til TfR-målrettede BBB-bærende antistoffer, viste både mono – Og bivalente fc5fc-fusjonsproteiner en lignende frekvens av transcytose in vitro, lignende plasma/CSF farmakokinetiske profiler og lignende systemisk potens i farmakodynamikkmodellen in vivo, til tross for forskjeller i tilsynelatende bindingsaffinitet og valens (Farrington et al., 2014). Disse studiene viste AT BBB-krysset single-domene antistoff FC5 kan brukes som en PLATTFORM BBB bærer i begge, heterodimerized «halv-antistoffer» og som lettere skalerbar bi – eller tetravalent fusjon til konvensjonelle IgGs(Farrington et al ., 2014).En annen potensiell fordel Med VHHS som BBB-bærere er deres naturlige motstand mot ekstreme biofysiske utfordringer, som temperatur og pH, samt proteaseforringelse (Kim Et al., 2014), ofte oppstått i ulike endocytiske rom under transcytose. Både FC5 og FC5Fc fusjoner internaliseres I BEC via clathrin-belagte vesikler, og sorteres til tidlige endosomer. Interessant, FC5 ble også funnet å stimulere shedding av ekstracellulære mikrovesikler (eksosomer)FRA BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) hvor BÅDE FC5 og økte nivåer av sin antatte reseptor Cdc50A ble påvist Ved Western blot og målrettet massespektrometri. Denne studien foreslo at kaste eksosomer kan være den endelige vesikkel AV RMT-banen frigjort fra abluminaloverflaten som bærer reseptor-antistoffkomplekset (skjematisk vist I Fig. 4). RMT-banen og eksosomformasjonen deler noen bemerkelsesverdige likheter. Som skissert i den første oppdagelsen av eksosomer, ble et anti-TfR-antistoff sporet av elektronmikroskopi i retikulocytter (Th ④ry, 2011) fra overflaten av cellene, inn i clathrin-belagte groper, inne i tidlige endosomer, på overflaten av indre vesikler av multivesikulære endosomer og til slutt på de frigjorte eksosomene etter fusjon av multivesikulære endosomer med plasmamembranen(Fig. 4). RMT ser ut til å utfolde seg på en lignende måte, OG BEC ekstracellulære mikrovesikler har vist seg å inneholde flere reseptorer kjent for å bære makromolekyler over BBB via RMT, inkludert TfR, LRPs, LDLR og IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
fra de beskrevne studiene bør det være tydelig at BBB-bærerarmen TIL CNS – målretting bsab krever nøye optimalisering for hver RMT-reseptor. Viktige hensyn i utformingen AV CNS-målretting bsAbs er omtalt nedenfor i lys av «lessons-learned» Fra TfR-BACE1 bsab utvikling og fra vårt eget arbeid MED FC5 SOM EN BBB-carrier antistoff.