9 Rollen Av Proteiner i Spliceosomal Katalytisk Kjerne
Sammenligne størrelsen på snrna med mye større gruppe II introner øker muligheten for at flere gruppe II intron domener kan ha blitt erstattet av proteiner i spliceosomes under utviklingen, noe som gir opphav til moderne ribonukleoprotein (RNP) eukaryote spleising maskiner. Selv om ingen-til-en-korrespondanse eksisterer, er det lett mulig å identifisere spliceosomale proteiner som utfører en funksjon mediert AV RNA-elementer i gruppe II-introner. For eksempel, en rekke U2-assosierte proteiner funksjon i å initiere Og stabilisere U2 snRNA-gren nettstedet interaksjon (Fig. 6.3).5,85 i gruppe II introner er u2-ekvivalenten (del av domene VI) kovalent knyttet til grenstedet via en hyperstabil hårnålsløyfe i et arrangement som sikrer dannelsen og stabiliteten av deres interaksjon (Fig. 6.2). Fra dette evolusjonært perspektiv er det ikke overraskende at en stor brøkdel av spliceosomale proteiner direkte forbinder med en snRNA, som ofte hjelper den i sin funksjon.5,85 men mange spliceosomale proteiner er involvert i å utføre regulatoriske funksjoner som ikke er nødvendig i sammenheng med en selv-skjøting intron og er sannsynlig å være nyere tillegg til spliceosomal protein komplement.som nevnt ovenfor er det antatt at den siste felles stamfar til eukaryoter hadde et høyt utviklet, fullt funksjonelt spliceosom som lignet de som finnes i moderne eukaryoter.1,2 Selv om dette spliceosomet sannsynligvis inneholdt betydelig færre komponenter sammenlignet med selv de minste moderne spliceosomer, indikerer data at de fleste av nøkkelkomponentene var tilstede i de tidligste versjonene av spliceosomene.1-4 faktisk viser en delmengde av det spliceosomale proteomet som inneholder proteiner assosiert med den katalytiske kjernen et betydelig bevaringsnivå blant forskjellige eukaryotiske arter, med en rekke spliceosomale proteiner blant de mest konserverte cellulære proteiner.85,86
som nevnt ovenfor er mange godt karakteriserte ribozymer assosiert med proteiner in vivo som forbedrer deres katalytiske aktivitet ved flere kjente mekanismer.83 Disse inkluderer stabilisering av rnas funksjonelle struktur, bistå i binding og posisjonering av substratene, og bistå i binding av funksjonelt viktige metallioner. Direkte deltakelse i katalyse er imidlertid hittil ikke observert for noen av de undersøkte ribozymassosierte proteinene.83,87 hvis man antar at spliceosomet er ET rna-enzym, er spliceosomal snRNAs uvanlige ribozymer i mange henseender. Kanskje viktigst er de uvanlig små for en ribozymkatalyserende fosfodiesterbindingsspaltning via aktivering av en ikke-tilstøtende nukleofil. Andre naturlige ribozymer som katalyserer slike reaksjoner, nemlig gruppe I OG II introner Og RNase P, er minst to ganger lengre enn den kombinerte lengden av humane U6 og U2 snrna. Disse ribozymene er også mye større enn de nukleolytiske ribozymene som aktiverer en tilstøtende 2 ‘ – hydroksyl nukleofil for fosfodiesterbindingsspaltning.24,88,89 den større størrelsen antas å tillate disse ribozymene å kaste seg inn i komplekse strukturer stabilisert av flere tertiære interaksjoner, noe som igjen gjør dem i stand til å skape sofistikerte aktive steder som er i stand til nøyaktig posisjonering av spaltningsstedet, de aktive stedmetalioner og den eksterne nukleofilen for in-line nukleofil angrep. Det er tenkelig At U6 Og U2 snrna, på grunn av deres korte lengde, i beste fall danner et ineffektivt spleising ribozym som krever andre spliceosomale faktorer for stabil posisjonering av de aktive stedelementene og de reagerende gruppene.
Prp8, som er det mest konserverte spliceosomale proteinet, antas å spille en slik rolle i det spliceosomale aktive stedet. Prp8 er uten tvil det mest interessante av spliceosomale proteiner, da det er uvanlig konservert med 61% identitet mellom gjær og menneske.86 det har imidlertid få klart skillebare funksjonelle motiver i sin ~ 2300 aminosyrelengde, og de funksjonelle domenene som hittil er blitt skilt, er degenererte og sannsynligvis utfører funksjoner som ikke er relatert til den cellulære rollen til det opprinnelige grunnmotivet.86 På Den annen Side spiller Prp8 klart en svært kritisk rolle i det spliceosomale aktive stedet. Det har blitt tverrbundet til 5′ og 3 ‘ spleisestedene og grenstedet for premessenger Rna, i tillegg Til U5 Og U6 snrna, noe som indikerer at den er tilstede i spliceosomal katalytisk kjerne og direkte kontakter de kritiske aktørene i spleisingsreaksjonen.86,90 videre har Det vist Seg At Prp8 interagerer med flere viktige spliceosomale proteiner, inkludert Snu114 Og Brr2 (se nedenfor).86,91,92
Mutasjoner I Prp8 er forbundet med et bredt spekter av spliceosomale defekter, inkludert endringer i spliceosomers evne til å avvise suboptimale spleisesteder og undertrykkelse av defekter forårsaket av mutasjoner i Andre spliceosomale faktorer som Prp28, Brr2, U4 og U6 snrna.86,93,94 en undergruppe Av Prp8 mutanter modulerer selektivt effektiviteten av enten det første eller det andre trinnet av spleising, spesielt i suboptimale substrater.58,86,95-97 disse observasjonene forklares best av en hypotese om At Prp8 er involvert i stabilisering av alternative, gjensidig eksklusive aktive stedskonformasjoner som enten er klar for katalyse av første eller andre trinn av spleising, og at visse Prp8 mutanter kan føre til selektiv hyperstabilisering av en av disse tilstandene.58,96,98 mens betydelige bevis tyder På At Prp8 sannsynligvis er involvert i posisjonering av substratene og stabilisering av det aktive stedet, eksisterer det for tiden ingen direkte bevis som antyder eller avviser sitt ekstra engasjement i metallionkoordinasjon eller direkte deltakelse i spliceosomal katalyse.
denne usikkerheten stammer fra det faktum at svært lite er kjent om Hvordan Prp8 utfører sin funksjon. En innovativ transposon-mediert screening analyse indikerte at store områder Av Prp8 er svært følsomme for innsetting av transposoner og sannsynligvis fungere som en enkelt strukturell enhet, selv om det var mulig å sette inn transposoner eller dele Prp8 I to fragmenter på en rekke andre posisjoner uten tap av levedyktighet.90,92 Bortsett fra et degenerert nukleært lokaliseringssignal nær Sin n-ende og et degenerert RRM (RNA-gjenkjenningsmotiv) motiv i midten av proteinet, har bare to andre funksjonelle domener blitt identifisert i dette ~ 2300 aminosyre-lange proteinet.86
en degenerert variant AV mpn / Jab1-domenet som er assosiert med deubiquitinerende enzymer, er funnet nær C-terminus Av Prp8.86 Analyse av høyoppløselig struktur av Et fragment Av Prp8 som inneholder dette domenet har vist at metallionbindingsstedet til isopeptidasesenteret er svekket, og dermed virker det sannsynligvis ikke som et deubiquitinerende enzym.99,100 In vitro, et fragment Av Prp8 som inneholder dette domenet kan direkte binde seg til ubiquitin med en affinitet som var sammenlignbar med andre kjente ubiquitin-bindende proteiner.101 Flere kjente Prp8 mutasjoner som forstyrret skjøting også forstyrret in vitro ubiquitin binding, og dermed øke muligheten for en funksjonell rolle for ubiquitination i skjøting regulering. Viktigere, proteomiske analyser har indikert at flere spliceosomal faktorer, inkludert Sad1, Snu114, Rse1, Og Prp8 selv, er ubiquitinated in vivo, og videre spliceosomal kjernen protein Prp19 utviser e3 ubiquitin ligase aktivitet in vitro.101-105 videre spiller ubiquitin en rolle i dannelsen og vedlikeholdet av tri-snRNP, muligens ved å modulere Prp8-mediert regulering av funksjonen Til Brr2.102 Alternativt Er DET også mulig AT mpn / Jab1-domenet fungerer som en protein–protein interaksjonsplattform. En rekke mutasjoner I Prp8 som faller innenfor dette området resulterer i arvelig blindhet retinitis pigmentosa, 86 og disse mutasjonene svekket interaksjonen Mellom Prp8 Og Brr2 og Snu114.99
den høyoppløselige strukturen til et annet fragment Av Prp8 har blitt fastslått som omfatter en svært konservert region (69% aminosyreidentitet mellom gjær og menneske) som ligger nær Sitt C-terminale domene. Analyse av strukturen viste tilstedeværelsen av en β-hårnålfinger som lignet de som finnes i ribosomale proteiner og et degenerert RNase H-lignende domene.106-108 mens den generelle geometrien Til det RNase H-lignende motivet på nivået av sekundær og tertiær struktur var godt bevart, viste primærsekvensen et mye lavere bevaringsnivå, og bare en av de tre katalytiske rester er tilstede på det aktive stedet. Den konserverte rest, et aspartat, er involvert i å koordinere to katalytiske metallioner i det aktive stedet for kanoniske rnase H-domener. I en studie resulterte mutasjon av denne rest I Prp8 i gjær i ingen påvisbar vekstdefekt, noe som kunne indikere redundans eller mangel på en kritisk funksjon.108 i en annen studie kunne effekten ikke undersøkes siden mutasjonsindusert misfolding av proteinfragmentet.107 ingen metallionbinding ble observert av regionen som tilsvarer det aktive stedet For RNase H-domenet når krystallene ble dyrket i så mye som 200 mM MgCl2, noe som indikerer at det degenererte aktive stedet mangler metallionbindingsevne. Videre viste fragmentet Av Prp8 som inneholdt dette domenet en svært svak RNA-bindende evne, med En Kd fra 20 µ til over 200 µ avhengig av DE testede rna-artene.106-108 selv om fragmentet viste en svært lav affinitet for bindende Rna, viste det en preferanse for bindende duplex Rna som inneholdt fireveis veikryss.108 i aktiverte humane spliceosomer forventes U2 og U6 snrna å danne en slik struktur.53,69 Det som gjorde Dette RNase H-lignende domenet spesielt interessant var at aminosyrene som svarer til dets aktive område er plassert ved siden av rester I Prp8 som tidligere ble vist å krysse til 5 ‘ spleisestedet i prekatalytiske spliceosomer.109 effektiviteten av dannelsen av denne krysslinken ble imidlertid redusert da de prekatalytiske spliceosomene utviklet seg til å bli katalytisk aktive spliceosomale komplekser.109 den observerte reduksjonen i tverrbindingseffektivitet kan tolkes for å indikere at denne interaksjonen forstyrres i aktiverte spliceosomer. Alternativt kan samspillet vedvare, men dannelsen av tverrbåndet selv avskaffes på grunn av en mindre forandring i miljøet av de tverrbundne rester. Hvis dette degenererte RNase H – lignende domenet faktisk er plassert i nærheten av 5’ spleisestedet i katalytisk aktive spliceosomer, er det mulig at det kan delta i å stabilisere den aktive konformasjonen av snrna, plassere substratene i det aktive stedet og/eller koordinere katalytiske metallioner. Mens domenet i seg selv ikke kan binde rna eller metallioner, er det mulig at det i nærvær av andre aktive områdeelementer kan utgjøre en del av substratet eller metallionbindende lommer. Til tross for disse spennende mulighetene, Er Prp8s rolle i spliceosomal katalyse fortsatt usikker.