Biotin Og dets bindende partner Avidin brukes ofte i dag i molekylærbiologi for en rekke forskjellige teknikker og protokoller. I dette innlegget vil vi diskutere den naturlige rollen biotin, biotinylering, oppdagelsen av biotin-avidin interaksjon og bruk av biotinylering i molekylærbiologi!
Lær om in vivo biotinylering av bakterielle fusjonsproteiner
Biotin Er et essensielt vitamin for livet
selv om biotin er mest kjent for sin rolle i molekylærbiologi, er biotin (Vitamin H Eller Vitamin B7) først et essensielt koenzym som kreves av alle organismer for livet. Biotin syntetiseres bare av planter, de fleste bakterier og noen sopp, og dermed må pattedyr få vitaminet gjennom eksterne kilder. Mennesker absorberer det meste av biotin de trenger i tynntarmen fra mikrofloraen som bor der.Biotin Er En kofaktor som i sin aktive form er kovalent festet til det aktive stedet for viktige metabolske enzymer, inkludert biotinkarboksylase og dekarboksylaser. Disse enzymene katalyserer overføringen av karboksylgrupper til organiske syrer for å produsere viktige cellulære metabolitter. Biotin virker som en karboksylbærer fra en forbindelse til den andre. Disse biotinavhengige enzymene er essensielle for prosesser som glukoneogenese, lipogenese, aminosyremetabolisme og energioverføring.Biotinylering Er den generelle prosessen der biotin tilsettes til et protein eller makromolekyl. Biotin kan tilsettes enzymatisk eller kjemisk. Enzymatisk biotinylering forekommer naturlig i celler og er prosessen der biotin er kovalent bundet til et spesifikt lysin på det aktive stedet for et nylig syntetisert enzym. Biotin protein ligase (BPL) er ansvarlig for denne svært spesifikke post-translasjonelle proteinmodifikasjonen. De fleste organismer har mindre enn fem enzymer i hele proteomet som er biotinylert. I E. coli for eksempel Er Bpl, BirA, ansvarlig for biotinylering av bare ett lysin i hele organismen på biotinkarboksylbærerproteinet (BCCP).
Oppdagelse av biotin-avidin interaksjon
på slutten av 1930-tallet ble det observert at dyr matet en diett av primært eggehviter ville utvikle hudlesjoner og andre forferdelige helseproblemer. Denne sykdommen ble kalt «egg hvit skade» og ble bestemt til å være på grunn av en mangel I Vitamin H senere omdøpt Vitamin B7 / biotin. Egg hvit skade ville plage disse dyrene selv om deres diett ble supplert med biotin. Dermed ble noe i egghvite sekvestering biotin fra å bli absorbert. I 1940 Var Esmond E. Snell i stand til å rense proteinet som var ansvarlig for binding av biotin, avidin. Avidin ble treffende oppkalt etter kylling,»Avian», egg det ble renset fra. Snell senere bekreftet at avidin var faktisk den skyldige i eggehvite skade ved å mate rotter renset avidin (Kresege et al., 2004). Avidin er et glykoprotein som består av fire identiske underenheter som hver kan binde ett molekyl biotin.
Biotin og Avidin har en ekstremt sterk affinitet for hverandre. Faktisk er bindingen mellom dem en av de sterkeste ikke-kovalente protein-ligand-interaksjonene som finnes i naturen. Når bindingen er dannet, påvirkes den ikke av endringer i pH, temperatur eller organiske løsningsmidler.
Bruk av biotin i molekylærbiologi
Biotin Er et relativt lite, vannløselig molekyl som ikke forstyrrer makromolekylene det legges til. Biotin har også en eksponert sidekjede som lett kan manipuleres for å lage reaktive arter uten å påvirke avidin-bindingsstedet. Med alle disse funksjonene er det ikke overraskende at forskere begynte å utnytte biotin og dets sterke samspill med avidin for molekylærbiologi og bioteknologiske formål. Når et polypeptid er biotinylert (mer om dette nedenfor), kan det inkuberes eller samuttrykkes med avidin eller et strukturelt lignende protein som ble oppdaget på 1960-tallet, strepavidin. Biotin-avidin-komplekset kan deretter brukes og / eller manipuleres for en forskers tiltenkte formål. To av de vanligste bruksområdene for biotinylering i laboratoriet er proteinrensing og immunoprecipitasjonsforsøk. Biotinylerte proteiner eller komplekser kan lett renses ved hjelp av kolonner eller perler som er belagt med avidin.
biotin-avidin-interaksjonen er også tilpasset for bruk i immunhistokjemi og antistoffmerking. I disse forsøkene legges biotin til et primært eller sekundært antistoff som retter seg mot henholdsvis protein av interesse eller primært antistoff. Avidin bundet til en reporter blir deretter lagt til reaksjonen for enkel gjenkjenning. De flere biotinbindingsstedene som finnes på avidin, er også ideelle for signalforsterkning under disse forsøkene. Under deteksjon kan et biotinylert reporterenzym som er pre-inkubert med fri avidin, legges til prøven. Eventuelle gratis biotinbindingssteder på dette komplekset kan binde seg til ditt biotinylerte antistoff. Dette skaper et stort meshwork av biotin – avidin komplekser bundet til protein av interesse som fører til forsterkning av reportersignalet og lettere deteksjon. Denne strategien er referert til som AVIDIN-Biotin Complex (ABC) immunhistokjemi (IHC). For mer informasjon OM ABC og IHC sjekk Ut Thermo Fisher Scientific ‘ s guide.
det finnes en rekke andre molekylærbiologiske applikasjoner for biotin og avidin. En kort liste over noen andre vanlige programmer og lenker til relevante papirer og nettsider er listet opp nedenfor.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin og avidin, makromolekyler av interesse først må biotinyleres. Forskere har utviklet flere metoder for kjemisk biotinylat makromolekyler av interesse både in vitro og in vivo.
Biotinyleringsreagenser:
Biotins eksponerte sidekjede kan kryssbindes til aminosyrefunksjonelle grupper in vivo via spesialiserte kjemikalier (biotinyleringsreagenser). Det finnes en rekke biotinyleringsreagenser tilgjengelig som varierer i funksjonelle grupper eller rester de målretter mot, så vel som deres oppløselighet, og dermed er forskjellige reagenser nyttige for biotinylering i forskjellige mikromiljøer. Det er også reversible og spaltbare biotinyleringsreagenser for å hjelpe til med den spesifikke elueringen av biotinylerte proteiner. For hjelp til å bestemme hvilke biotinyleringsreagenser som skal brukes, sjekk Ut Thermo Fisher Scientific ‘ S Biotinyleringsreagensvalgsverktøy.
Avitag Og BirA:
Proteiner kan også biotinyleres ved å utnytte spesifisiteten Til E.coli BPL, BirA. Hvis Du husker, biotinylerer BirA bare ett lysin i Hele e. coli proteomet. Ved hjelp av denne kunnskapen identifiserte forskere 13-aminosyresekvensen som kreves for BirA-anerkjennelse og biotinylering. Denne 13 aminosyresekvensen kalles AviTag. Ved Hjelp av avitag kan man merke et protein av interesse med biotin ved ganske enkelt å skape en fusjon der AviTag legges til Enten N-eller C-enden av proteinet. BirA har vist seg å effektivt biotinylere avitag som uttrykker proteiner i bakterier, gjær, insekt og pattedyrceller. Sjekk Ut Kay et al., 2009 for metoder på biotinylerende proteiner med BirA.
du kan finne plasmider som inneholder Både Avitag og BirA På Addgene!
Oligonukleotidmerking:
Biotin kan tilsettes til hver ende av EN DNA-sekvens under En Polymerasekjedereaksjon (PCR) ved å bruke en biotinylert primer. Biotin kan også inkorporeres enzymatisk under PCR ved bruk av et biotin merket dUTP. Det finnes flere typer biotinetiketter som kan legges til et oligonukleotid, avhengig av din nedstrøms applikasjon. Biotin-merkede oligonukleotider kan brukes i en rekke applikasjoner, inkludert men ikke begrenset til in situ hybridisering, blotting (Nord og Sør) og affinitetsbinding.
Fotobiotinylering:
Fotobiotin kan brukes til ikke-selektivt å merke DNA og RNA. Fotobiotinacetat består av et biotinmolekyl festet til en fotoreaktiv arylazidgruppe. Under sterkt synlig lys blir arylazidgruppen reaktiv og danner en kobling med nærliggende nukleinsyrer (McInnes et al., 1990). Fotobiotinylering er noen ganger enklere og billigere enn andre enzymatiske metoder. Forskere har ofte brukt denne metoden for å feste proteiner eller polypeptider til et fast substrat (Holden og Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A.,& Cronan, J. E. «Molekylærbiologi Av Biotin Vedlegg Til Proteiner; Symposium: Ernæring, Biokjemi og Molekylærbiologi Av Biotin» J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. «den enzymatiske biotinylering av proteiner: en post-translasjonell modifikasjon av eksepsjonell spesifisitet.»Trender I Biokjemiske Fag, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. «Biotin: det glemte vitaminet.»American Journal Of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180 . PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. Og R. L. H. «Oppdagelsen Av Avidin Av Esmond E. Snell.»J Biol Chem 279.e5 (2004). Publisert PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. » Biotinylering Av Proteiner Med Høy Gjennomstrømning .»Metoder Mol Biol, 498 (2009): 185-196 . PubMed PMID: 18988027. PubMed Sentral PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C.,& Symons, R. H. » Forberedelse og bruk av fotobiotin.»Metoder I Enzymologi 184 (1990): 588-600 . PubMed PMID: 2388593
7. Holden, Ma, & Cremer, Ps «lysaktivert mønster av fargestoffmerkede molekyler på overflater.»Journal Of American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, j. feng, Liu, n. hua, Shu, l. yuan, & Sun, H. «Anvendelse av avidin-biotin teknologi for å forbedre celle adhesjon på nanofibrous matriser.»Journal Of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Sentral PMCID: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. » en ikke-radioaktiv metode for liten rna-deteksjon ved nordlig blotting.»Rice 7.1 (2014): 1-7 . PubMed PMID: 26224555. PubMed Sentral PMCID: PMC4884002.
10. Boer, E. De, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. » Effektiv biotinylering og enkelt-trinns rensing av merkede transkripsjonsfaktorer i pattedyrceller og transgene mus.»PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Sentral PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. » Oppdrift-Aktivert Cellesortering Ved Hjelp Av Målrettede Biotinylerte Albumin Mikrobobler .»PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Sentral PMCID: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, Sa «Biotinylerte prober i elektroforetisk mobilitet skift analyse for å undersøke spesifikke dsdna, ssDNA eller RNA–protein interaksjoner.»Nukleinsyreforskning, 23.18 (1995): 3792-3793 . PubMed PMID: 7479014. PubMed Sentral PMCID: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, A. Y. » Avbildningsproteiner i levende pattedyrceller med biotinligase og monovalent streptavidin.»Naturprotokoller 3.3 (2008): 534-545 . Publisert PMID: 18323822. PubMed Sentral PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. » Biotinylerte prober for in situ hybridisering histokjemi: bruk for mRNA deteksjon .»Journal Of Histochemistry and Cytochemistry: Offisiell Journal Av Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
Flere ressurser på Addgene bloggen
- in vivo biotinylering av bakterielle fusjonsproteiner
- Lær hvordan biotin brukes I Split-BioID: en forbedret metode for å studere protein-protein interaksjoner
- Lær hvordan biotin kan brukes med CRISPR