Riktig Markør For Astrocytter: Sammenligning Av Fordelingen Og Uttrykket Av Tre Astrocytiske Markører i Forskjellige Mus Cerebrale Regioner

Abstract

Astrocytter har forskjellige morfologiske egenskaper avhengig av hjerneområdet der de er funnet. Imidlertid kan ingen av de nåværende astrocytiske markørene merke alle subpopulasjoner vellykket. Det er derfor kritisk å identifisere riktig markør for en bestemt vitenskapelig undersøkelse. Her sammenlignet vi fordelingen og proteinuttrykket av tre astrocytmarkører: NDRG2, GFAP og S100ß, i cortex, hippocampus og thalamus. NDRG2 – Og S100ß-positive astrocytter ble fordelt mer jevnt enn GFAP-positive astrocytter i hele cerebrum. NDRG2 og S100ß immunoreaktivitet var sterkest i dorsal cortex og thalamus, MENS GFAP immunoreaktivitet var sterkest i hippocampus. Videre var proteinuttrykksnivåene AV NDRG2, GFAP og S100ß hos voksne mus de høyeste i henholdsvis cortex, hippocampus og thalamus. Vi oppdaget også astrocytmorfologi og fant AT I corpus callosum og cerebral peduncle ble GFAP-positive astrocytter funnet med flere tallrike og lengre prosesser enn NDRG2 – og S100ß-positive astrocytter. Disse resultatene viser at NDRG2 Og S100ß er mer hensiktsmessig brukt til å visualisere den totale fordeling og endringer i antall astrocytter, samt etikett astrocytter i cortex og thalamus. GFAP er imidlertid mer hensiktsmessig brukt til å merke astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og hippocampus. Disse resultatene bidrar til å veilede forskere i valg av passende astrocytmarkør og foreslå forskjeller i immunologiske kvaliteter av astrocytter basert på vevet der de er funnet.

1. Innledning

Astrocytter har lenge vært ansett som hjelpeceller som bare gir trofisk, metabolsk og strukturell støtte til nevroner . Men de siste årene har omfattende forskning vist at de spiller avgjørende roller i cerebrale fysiologiske og patologiske funksjoner. Astrocytter hjelper til med vedlikehold av ion homeostase og blod-cerebrale barrierer, synapsdannelse og fjerning, samt kontroll av cerebral blodstrøm og regulering av nevrotransmittergjenvinning, glutamat excitotoksisitet og antioksidantstress . Det er viktig at astrocytter har morfologiske, populasjons-og funksjonelle forskjeller i forskjellige hjernegrupper . Derfor er identifisering av den mest hensiktsmessige markøren for polymorf og flere undergrupper av astrocytter kritisk for forskning på astrocytisk multifunksjon.Glialfibrillært surt protein (GFAP) er den mest brukte astrocytiske markøren, men SOM det viktigste intermediære filamentet som komponerer cytoskelettet, ble GFAP immunmerket bare ca. 15% av det totale astrocytvolumet, og mer enn 40% av astrocytene FUNNET Å VÆRE GFAP-negative hos den voksne rottehippocampus . I TILLEGG merket GFAP protoplasmatiske humane astrocytter dårlig og ble uttrykt sent i utviklingen av fibrøse astrocytter .

En annen vanlig brukt astrocytisk markør Er S100ß, Et Ca2 + bindende peptid rikelig i cytoplasma, og kjernen av astrocytter som er involvert i cellesyklusregulering og cytoskelettmodifisering . Imidlertid uttrykkes S100ß også i en subpopulasjon av modne oligodendrocytter, i choroid plexus epitelceller og i noen få nevroner . Manglene PÅ GFAP og S100ß ved merking av astrocytter kan føre til unøyaktigheter eller feil i å utforske funksjonene til astrocytter.n-Myc nedstrøms-regulert gen 2 (NDRG2) ble først oppdaget i et normalt humant cerebral cDNA-bibliotek ved EN PCR-basert subtraktiv hybridiseringsmetode . Det er et tumor suppressor og celle stress-relatert gen assosiert med celleproliferasjon og differensiering . NDRG2 er mye uttrykt i hjernebarken, olfaktorisk pære, midcerebral, hippocampus og thalamus . VIKTIGST ER NDRG2 spesifikt uttrykt i astrocytter i hjernen . SÅLEDES betraktes NDRG2 som en ny astrocytisk markør, spesielt for modne, ikke-reaktive og ikke-prolifererende astrocytter . Det er imidlertid ikke rapportert om NDRG2 er mer pålitelig enn GFAP og S100ß som astrocytisk markør, samt forskjeller i distribusjon og ekspresjon i forskjellige hjerneregioner.

i den nåværende studien sammenlignet vi distribusjon, proteinuttrykk og gjensidig kolokalisering av astrocytiske markører NDRG2, GFAP og S100ß gjennom hele cerebrum av mus. Vi forsøkte å identifisere den mest egnede markøren for astrocytter i forskjellige hjernegrupper.

2. Materialer og Metoder

2.1. Dyr

Unge, voksne OG gamle C57BL / 6 mannlige mus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder ble hentet fra Forsøksdyrsenteret Ved Central South University. Dyrene var fri til å spise og drikke, holdt ved en temperatur på 25 ± 1°C, og plassert med en 12: 12-h lys-mørk sirkel for å simulere dyrets sirkadiske rytme. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyrs lidelse og for å redusere antall dyr som ble brukt. Alle dyreforsøk prosedyrer fulgte en protokoll godkjent av Etisk Utvalg For Dyreforsøk av Central South University Animal Care And Use Committee, Kina.

2.2. Cellekulturer

HT22-cellene (en nevroncellelinje) og MA1800-57-celler (en astrocytcellelinje) ble dyrket i Dulbeccos Modifiserte Eagle-Medium (DMEM, Hyklon) som inneholdt 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco), 50 E/mL penicillin og 50 µ/mL streptomycin. OLN-93-cellene (en oligodendroglial cellelinje) ble oppbevart i DMEM supplert med 10% FBS, 2 mM Glutamin, 50 E/mL penicillin og 50 µ / mL streptomycin. Cellene ble alle opprettholdt på 37°C i en blanding av 95% atmosfærisk luft og 5% CO2. HT22-cellene, OLN-93-cellene og MA1800-57-cellene ble sådd på lysbilder og ble farget med antistoffer mot henholdsvis mikrotubuliassosiert protein 2 (MAP2), α-tubulin og GFAP.

2.3. Immunfluorescens Fargeanalyse

etter at musene ble bedøvet med natriumpentobarbital (50 mg/kg), ble deres cerebramer ekstrahert og festet med 0,9% kald heparinisert saltvann og 4% paraformaldehyd. Etter postfiksering ble cerebraene fortløpende dehydrert i 20% sukrose og 30% sukrose-løsninger. Seksjoner av 10 µ tykkelse ble tilberedt ved bruk Av en leica CM1900 fryst skiver. Hjerneseksjonene ble inkubert i 1% H2O2 i 15 minutter og 0,3% Triton X-100 i 15 minutter, med 3×vask i pbs postinkubasjon mellom hver behandling. Seksjonene ble deretter blokkert i 5% normalt geiteserum i 1 time ved romtemperatur og inkubert over natten ved 4°C i en fuktighetsboks med primære antistoffer som følger: anti-gfap-antistoff mot mus (#3670, 1:500, Cellesignalteknologi); anti-ndrg2-antistoff mot kanin (#5667, 1:200, Cellesignalteknologi); anti-NDRG2-antistoff mot mus (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); anti-s100ß antistoff mot kanin (#2017-1, 1:500, epitomics); anti-glutaminsyntetase (gs) antistoff mot mus (#mab302, 1:200, millipore); anti-map2-antistoff mot kanin (#Ab32454, 1:500, abcam); og anti-α-tubulin Antistoff mot mus (#t6199, 1:500, Sigma). Deretter ble seksjonene inkubert med blandinger Av Alexa-488 (grønn, Invitrogen) Og Alexa-647(rød, Invitrogen)-konjugert esel anti-kanin eller esel anti-mus sekundære antistoffer for 2 h i mørket ved romtemperatur. 4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) ble brukt til å flekke kjerner. Seksjonene ble montert med 50% glyserol. Til slutt ble seksjonene sett og fotografert ved hjelp Av Et Olympus BX51 (Japan) fluorescensmikroskop. Antistoffene som ble brukt i vår studie ble mye brukt i våre tidligere studier og av andre etterforskere , og følsomheten og spesifisiteten til disse antistoffene er bekreftet.

2.4. Western Blot

cortex, hippocampus og thalamus ble samlet fra c57bl / 6 mus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder. Prøvene ble homogenisert I RIPA buffer, og konsentrasjonen av proteinprøvene ble målt VED BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, USA). Proteinprøvene ble separert med 10% SDS-PAGE (Sds-PAGE Gel kit, CW0022S, Kina) og elektrisk overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Komponentene i SDS-PAGE Gel-settet inkluderte en 30% Acr-Bis, Sds-PAGE Separerende Gelbuffer, Sds-PAGE Stabling Gelbuffer, aps (ammoniumpersulfat) og TEMED (N, N, N’, N’-tetrametyletylendiamin). Deretter ble membranene blokkert i 5% ikke-fett tørr melk fortynnet I TBST (TBS med 0,05% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med spesifikke primære antistoffer: mus anti-GFAP antistoff (#3670, 1:1000, Cellesignalteknologi); kanin-ANTI-NDRG2-antistoff (#5667, 1:1000, Cellesignalteknologi); kanin-Anti-S100ß-antistoff (#2017-1, 1:1000, Epitomikk); og kanin-ANTI-GAPDH-antistoff (#5174, 1:1000, Cellesignalteknologi) over natten ved 4°C. membranene ble deretter inkubert med ET HRP-konjugert sekundært antikanin-eller antimusantistoff (Thermo Scientific, usa) for 2 H. Kjemiluminescerende signaler BLE UTVIKLET VED HJELP AV VESTLIG LYN kjemiluminescens reagens pluss (perkinelmer life sciences; Wellesley, MA) og oppdaget AV et bildeanalysator LI-COR Odyssey-System (LI-COR Biotechnology, USA). Immunoreaktiviteten til proteinbånd ble kvantitativt analysert av Bio-Rad® Billaboratorium™ Båndtetthetsverdier ble normalisert TIL GAPDH.

2.5. Kvantitativ (Sanntids) Polymerasekjedereaksjon (SANNTIDS PCR)

cortex, hippocampus og thalamus ble samlet fra c57bl / 6 mus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder. Totalt RNA ble isolert ved Hjelp Av Et TransZol Up Pluss RNA-Sett (Kode Nr. ER501-01, Transgen, Kina) og kvantifisert Ved Hjelp Av En NanoDrop 2000. Deretter ble 1000 ng av totalt RNA transkribert omvendt i en 20 µL reaksjon ved 42°C i 15 min, etterfulgt av 85°C i 5 sek ved bruk av En TransScript® alt-i-Ett-cDNA-Syntese SuperMix for qPCR (Kode Nr. AT341, Transgen, Kina). Komponentene i settet inkluderte en 5×TransScript Hryvnias All-in-One SuperMix for qPCR (TransScript® rt, Rnasehemmer, Forankret Oligo(dT)18 Primer, Tilfeldig Primer(N9), dNTPs, buffer), en 5×transscript® Alt-i-Ett No-RT Kontroll SuperMix for qPCR, en gDNA-Fjerner og Et rnasefritt vann. Den 5×TransScript® Alt-i-ETT No-RT Kontroll SuperMix for qPCR ble brukt som en negativ kontroll. Real-time PCR ble utført i en 20 µ reaksjon i henhold til produsentens håndbok For TransStart Tips Grønn Qrna SuperMix (Kode Nr. AQ141, Transgen, Kina). MRNA-primersekvensene som brukes, finnes I Tabell 1. Reaksjonen ble utført ved 94 hryvnias C i 30 sek etterfulgt av 40 sykluser av 94 hryvnias C i 5 sek, 60 hryvnias C i 15 sek og 72 hryvnias C I 19 sek på ViiA7 Real-Time PCR-Deteksjonssystem (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). Primere og sekvenser avledet fra det relative mRNA-uttrykket ble analysert ved hjelp av formelen .

2.6. Statistisk Analyse

Statistiske tester ble utført ved HJELP AV PRISM v7. 0 software (GraphPad). Sammenligninger mellom to grupper ble utført ved Hjelp Av Studentens t-tester. Sammenligninger mellom ulike grupper ble utført ved hjelp av enveis ANOVA Med Tukeys posttest. Alle verdier ble presentert som middelmådig sd. Verdier av p <0,05 ble vurdert som statistisk signifikante.

3. Resultater

3.1. Fordelingen Av Astrocytter Merket AV NDRG2, GFAP og S100ß i Forskjellige Cerebrale Regioner

regionene til mus cerebra ble identifisert ved merking av cellekjernene. I tillegg ble en tilsvarende mus hjerneatlas brukt til å verifisere de spesifikke områdene som ble analysert (Figur 1). Vi brukte deretter immunfluorescensfarging for å oppdage fordelingen av astrocytter merket AV NDRG2, GFAP og S100ß i forskjellige cerebrale regioner hos voksne hannmus i alderen 6 måneder. NDRG2 – Og S100ß-positive astrocytter var mer tallrike og jevnere fordelt enn GFAP-positive astrocytter i hele cerebrum (Figur 2). NDRG2-positive astrocytter ble konsentrert i dorsal cortex (Region 1) og thalamus (Region 5), men i mindre grad i hippocampus (Region 4), corpus callosum (Region 3) og ventral cortex (Region 2) og minst i cerebral peduncle (Region 6) (Figur 2(a) og 2 (b)). GFAP-positive astrocytter ble konsentrert mest i hippocampus; mindre ble påvist i corpus callosum og cerebral peduncle og nesten uoppdagelig i dorsal cortex, ventral cortex og thalamus (Figur 2 (a) og 2 (c)). S100ß-positive astrocytter ble konsentrert mest i dorsal cortex og thalamus, mindre så i hippocampus og ventral cortex, og minst av alt i cerebral peduncle og corpus callosum (Figur 2(b) og 2(c)). Fordelingen AV NDRG2-positive astrocytter var lik den For S100ß-positive astrocytter.

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 2

The distribution of astrocytes labeled by NDRG2, GFAP and S100β throughout the cerebrum. Representative immunfluorescensbilder av astrocytter merket MED GFAP OG NDRG2 (a), S100ß og NDRG2 (b), GFAP og S100ß (c) i cerebrum hos voksne hannmus (6 måneder) ved lav forstørrelse. Region 1: dorsal cortex; Region 2: ventral cortex; Region 3: corpus callosum; Region 4: hippocampus; Region 5: thalamus; Region 6: cerebral peduncle. n = 6. Skala barer = 500 µ

Astrocytter i forskjellige cerebrale regioner presenterte ulik immunoreaktivitet for NDRG2, GFAP og S100ß (Figur 2). Astrocytter i dorsal cortex og thalamus reagerte sterkt PÅ NDRG2 og S100ß, men svakt på GFAP. Astrocytter i hippocampus reagerte sterkt PÅ GFAP og moderat TIL NDRG2 Og S100ß. Astrocytter i ventral cortex, corpus callosum og cerebral peduncle reagerte svakt til moderat TIL NDRG2, GFAP og S100ß (Tabell 2).

GFAP NDRG2 S100β Cortex (dorsal) + +++ +++ Cortex (ventral) + ++ ++ Corpus callosum ++ + + Hippocampus +++ ++ ++ Thalamus + +++ +++ Cerebral peduncle

+++: sterkt positiv;++: moderat positiv;+: svakt positiv.

Tabell 2

Astrocytisk immunoreaktivitet TIL NDRG2, GFAP og S100ß i forskjellige cerebrale regioner.

fordelingen av astrocytter merket MED NDRG2, GFAP og S100ß i forskjellige cerebrale regioner hos hannmus var lik den hos gamle hannmus (12 måneder) (Figur 3).

3.2. Morfologiene Av Astrocytter Merket AV NDRG2, GFAP og S100ß i Forskjellige Cerebrale Regioner

Astrocytter er hovedsakelig delt inn i to typer: fibrøse astrocytter i hvit materie og protoplasmatiske astrocytter i grå materie. Derfor sammenlignet vi morfologiene til de to typene merket av forskjellige markører i corpus callosum (hvit materie, Region 3) og hippocampus (grå materie, Region 4) (Figur 4). Resultatene fra voksne hannmus (6 måneder) viste AT NDRG2-og S100ß-positive astrocytter presenterte en stellatform preget av stor og rund soma sammen med korte og grove cytoplasmatiske prosesser som hadde få grener. GFAP-positive astrocytter presentert med en radial form preget av små soma, lange prosesser, og multibranches (Figur 4). Videre, i corpus callosum og cerebral peduncle, astrocytter merket AV GFAP presentert med mer rikelig lengre prosesser enn de som er merket AV NDRG2 Og S100ß (Figur 5 og 7).

3.3. Kolokaliseringen AV NDRG2, GFAP og S100ß innen Astrocytter i Forskjellige Cerebrale Regioner

NDRG2 ble nesten kolokalisert MED GFAP i astrocytter i ventral cortex, corpus callosum og cerebral peduncle, og for det meste kolokalisert MED GFAP i astrocytter av hippocampus (Figur 5 og 8(a)). NDRG2 hadde nesten ingen kolokalisering med GFAP i astrocytter av dorsal cortex og thalamus (Figur 5). NDRG2 og S100ß presenterte nesten fullstendig kolokalisering i astrocytter i de seks hjerneregionene (Figur 6 og 8 (b)). GFAP og S100ß presentert med signifikant kolokalisering i astrocytter av ventral cortex, corpus callosum og cerebral peduncle og nesten fullstendig kolokalisering i astrocytter av hippocampus (Figur 7). GFAP og S100ß hadde nesten ingen kolokalisering i astrocytter i dorsal cortex og thalamus (Figur 7).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figure 8

The colocalization and protein expression of NDRG2, GFAP, Og S100ß i forskjellige hjerneregioner. (a)-(b) den kvantitative analysen AV NDRG2+ / GFAP + astrocytter OG NDRG2+ / S100ß + astrocytter. Resultatene ble presentert som middelmådig sd. Celler i fem felt ble talt. (c)-(e) ekspresjonsnivåene FOR ndrg2, GFAP og S100ß proteiner i cortex, hippocampus og thalamus hos voksne hannmus (6 måneder) ble bestemt Ved Western blot analyse. Representative blotter og kvantitativ analyse ble vist. Resultatene ble presentert som gjennomsnittlig ± SD og analysert av enveis ANOVA med Tukey ‘ s posttests. n = 6. p < 0.05, p<0,01, og p < 0,001.

vi oppdaget også kolokalisering AV NDRG2 og en annen astrocytisk maker, glutaminsyntetase (GS), i astrocytter av musens cerebrum. NDRG2 og GS hadde signifikant kolokalisering i astrocytter (Figur S1a). NDRG2 og GS presenterte grundig kolokalisering i fibrøse astrocytter av corpus callosum og i protoplasmatiske astrocytter av hippocampus (Figur S1b). NDRG2 – proteinuttrykk i NEVRONCELLELINJEN HT22-celler, oligodendroglialcellelinje OLN-93-celler og astrocytisk cellelinje MA1800-57-celler ble også påvist (Figur S2). NDRG2-protein ble påvist I ma1800-57-celler og ble knapt oppdaget I HT22-celler OG OLN-93-celler (Figurer s2a og s2b).

3.4. Uttrykket AV Ndrg2, GFAP Og S100ß Proteiner i Forskjellige Cerebrale Regioner

vi brukte western blotting til å oppdage uttrykksnivåene FOR NDRG2, GFAP og S100ß proteiner i tre cerebrale regioner hos voksne hannmus (6 måneder): cortex, hippocampus og thalamus (Figur 8 (c)). Vi analyserte uttrykksnivåene for disse markørene i samme hjerneområde (Figur 8 (d)). I cortex var NIVÅET AV ndrg2-uttrykk markert høyere ENN GFAP og S100ß uttrykksnivåer (p < 0,001, p <0,05). Uttrykksnivået For S100ß var også mye høyere ENN GFAP(p <0,05). I hippocampus var NIVÅET AV gfap-uttrykk høyere ENN NDRG2 og S100ß(p < 0.01), og NIVÅET PÅ NDRG2-uttrykk var litt mindre Enn s100ß-uttrykksnivået, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. I thalamus var uttrykksnivået For S100ß signifikant høyere ENN GFAP-og NDRG2-uttrykksnivåene(p < 0,01), mens NIVÅET AV NDRG2-uttrykk var lik DET FOR GFAP.

deretter analyserte vi uttrykksnivåene av samme markør i forskjellige hjernegrupper (Figur 8 (e)). Nivået PÅ ndrg2-uttrykk i cortex var mye høyere enn i hippocampus og thalamus (p<0,01), og ingen signifikant forskjell ble observert mellom hippocampus og thalamus. NIVÅET AV gfap-uttrykk i hippocampus var det høyeste blant de tre regionene (p <0,001, p<0,01); ingen signifikant forskjell ble observert mellom cortex og thalamus. Nivået Av S100ß uttrykk i thalamus var signifikant høyere enn i cortex og hippocampus(p < 0.01), uten signifikant forskjell observert mellom de to sistnevnte.

vi oppdaget også proteinnivåene AV NDRG2, GFAP og S100ß i cortex, hippocampus og thalamus hos hannmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder(Figur 9(a)-9 (f)). Proteinnivåene AV NDRG2 og GFAP i cortex, hippocampus og thalamus økte gradvis med alderen (p < 0,05, p < 0,01). Proteinnivåene Av S100ß i cortex og thalamus, men ikke i hippocampus, økte gradvis med alderen (p < 0.05,p<0,01, p < 0,001). Mrna-nivåene AV NDRG2, GFAP og S100ß i cortex, hippocampus og thalamus hos hannmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder var i samsvar med proteinnivåene (P<0,05, p<0,01, Figurer 9(g)-9(i)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figure 9

The expression of NDRG2, GFAP, and S100β in different cerebral regions of different aged male mice. (a)-(f). Nivåene AV NDRG2, GFAP og S100ß protein i cortex, hippocampus og thalamus hos hannmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder ble bestemt Ved Western blot analyse. Representative blotter og kvantitativ analyse ble vist. (g)-(i) nivåene AV NDRG2, GFAP og S100ß Mrna i cortex, hippocampus og thalamus hos hannmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder ble bestemt ved qpcr-analyse. Den kvantitative analysen ble vist. Gjennomsnittet av 1 måned ble standardisert til 1. Resultatene ble presentert som gjennomsnittlig ± SD og analysert Av Studentens T-tester. n = 6. p < 0,05, p < 0,01, og p <0,001. 1 m = 1 måned; 3 m = 3 måneder; 6 m = 6 måneder; 9 m = 9 måneder; 12 m = 12 måneder.

4. Diskusjon

i denne studien fant vi at astrocytter merket AV NDRG2 og S100ß ble distribuert mer bredt og jevnt enn de merket AV GFAP i hele storhjernen av unge, modne og gamle mus. DETTE antyder AT NDGR2 Og S100ß er mer hensiktsmessige markører for å observere den totale fordelingen og antall endringer av astrocytter. I tillegg viste våre resultater at astrocytter i forskjellige hjerneregioner presenterte ulike nivåer av immunoreaktivitet sammenlignet MED NDRG2, GFAP og S100ß, noe som tyder på AT I cortex og thalamus ER NDRG2 og S100ß mer passende astrocytiske markører enn GFAP. Den uovertrufne immunoreaktiviteten til astrocytter til NDRG2, GFAP og S100ß kan også skyldes sensitiviteten og spesifisiteten til antistoffene vi brukte. I tillegg var morfologiene av astrocytter merket AV NDRG2 og S100ß lik hverandre, men var åpenbart forskjellig fra de som var merket AV GFAP fordi disse markørene merket forskjellige cytoskeletale strukturer. NDRG2 flekker cytoplasma og cellemembraner og svakt flekker kjernen . GFAP flekker hovedsakelig soma og prosesser, men Ikke kjernen, Mens S100ß flekker kjernen og en del av cytoplasma og prosesser . Ved å sammenligne morfologiene av astrocytter merket AV NDRG2, GFAP og S100ß, fant VI AT GFAP var en mer egnet markør for astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og spesielt hippocampus. Proteinene NDRG2 og S100ß ble uttrykt mest i henholdsvis cortex og thalamus. Vi antar AT NDRG2 er mer egnet for astrocytter i cortex mens S100ß er mer egnet for astrocytter i thalamus når man kvantifiserer astrocytisk tetthet. De forskjellige proteinuttrykksmønstrene AV NDRG2, GFAP og S100ß i cortex, hippocampus og thalamus bekreftet astrocytisk funksjonell heterogenitet.Astrocytter har vist seg å spille en viktig rolle i opprettholdelsen av homeostase, og de deltar aktivt i nesten alle nevrologiske lidelser, som iskemiske slag, traumatiske hjerneskader, Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom . Det har blitt påvist at astrocytisk morfologi, genuttrykk og funksjon varierte mellom forskjellige regioner i cerebrum . Fibrøse astrocytter og protoplasmatiske astrocytter er to store subpopulasjoner identifisert av deres morfologi . Fibrøse astrocytter har lange, tynne prosesser og et stjernelignende utseende, mens de protoplasmatiske har mange fine prosesser, som kontakter og skjede synapser . Interessant er mange gener heterogent uttrykt av undergrupper av astrocytter. Disse genene koder for proteiner som glutamattransportører og ionekanaler , så vel som glutamat -, dopamin-og opioidreseptorer .

heterogeniteten av genuttrykk innebar det funksjonelle mangfoldet av astrocytter. For eksempel varierer glutamatopptak mellom forskjellige undergrupper . I tillegg varierer spontane kalsiumoscillasjoner mellom forskjellige lag av den somatosensoriske cortexen. Kortikale lag 1 astrocytter viste hyppig Asynkron Ca2 + aktivitet, mens lag 2/3 astrocytter viste sjelden synkron Ca2 + aktivitet . I cortex reagerer astrocytter på glutamat og norepinefrin med økning i kalsium, mens hippocampale astrocytter utviser kalsiumresponser PÅ ATP, GABA, glutamat, acetylkolin, prostaglandiner og endokannabinoider . Studier har også vist at dyrkede astrocytter fra forskjellige hjernegrupper har forskjellige kapasiteter for å stimulere neurittvekst og forgrening . Som astrocytter i forskjellige hjernegrupper presenterer forskjellige egenskaper ved morfologi og funksjon, er det avgjørende for astrocytiske forskere å identifisere den mest hensiktsmessige markøren for astrocytter i forskjellige hjernegrupper.

selv om flere proteiner har blitt rapportert selektivt uttrykt av astrocytter, har ingen vist seg å være helt begrenset til alle astrocytiske subtyper. GFAP, den mest brukte astrocytiske markøren, uttrykkes fortrinnsvis i hvite materie astrocytter over grå materie og unnlater å merke alle prosesser av astrocytter . Enda viktigere er det undergrupper AV GFAP-negative astrocytter som presenterer spenningsavhengige k + – strømmer, mens GFAP-positive astrocytter presenterer det klassiske mønsteret av tids-og spenningsuavhengige strømmer .

Tidligere studier fant At S100ß var i stand til å merke astrocytter i både grå og hvit substans; det ble imidlertid også uttrykt i noen få oligodendrocytter og nevroner . S100 hryvnias ble funnet å være mest uttrykt i thalamus astrocytter, en subtype av celler som deltar i rensing Av Dargisk avfall produsert ved degenerering Av Dargiske terminaler i Parkinsons sykdom ved å lette tilstedeværelsen av lysosomer og dannelsen av autofagosomer . Den transkriptomiske analysen av astrocytter identifiserte aldehyd dehydrogenase 1 familie, medlem L1 (ALDH1L1), som en astrocytisk markør . IMIDLERTID merket ALDH1L1 også oligodendrocytter . Tilsvarende hadde de eksitatoriske aminosyretransportørene glutamat / aspartattransportør (GLAST), glutaminsyntetase (GS), glutamattransportør-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, aquaporin 4 og celleoverflateglykoprotein CD44 også begrensninger ved merking av astrocytter .

NDRG2 er spesifikt uttrykt i astrocytter av både rotter og mus og er forbundet med veksten og modningen av den utviklende embryonale hjernen . I tillegg til celleproliferasjon, differensiering og transmembrantransport deltar NDRG2 også i stressresponser, depresjon, iskemiske sykdommer og nevrodegenerative lidelser . Hos mus og mennesker deltar NDRG2 i utviklingen av oppmerksomhetsunderskudd / hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD), en sykdom forbundet med lokomotasjonssenteret i hjernebarken . Flugge et al. oppdaget uttrykket AV NDRG2 i hjernen hos mennesker, marmoseter, treskrever, rotter og mus, og foreslo AT NDRG2 var en ny astrocytisk markør, spesielt for modne, ikke-reaktive og ikke-prolifererende astrocytter . I denne studien oppdaget vi først distribusjonsmønsteret FOR NDRG2-positive astrocytter i forskjellige cerebrale regioner og forskjeller med astrocyttene merket med klassiske markører GFAP og S100ß.

Astrocytter og astrocytiske markører endret seg under normal hjernealdring. Tidligere arbeid har vist at astrocytter aktiveres tidlig i aldring, og den signifikante økningen AV GFAP-positive astrocytter ble funnet i hippocampale regioner hos eldre mus . Nivåer av BÅDE GFAP-protein og gfap mRNA økte i ulike deler av aldrende hjerner, som hjernebarken, hippocampus og cerebellum . Avvik forblir blant ulike rapporter Om S100ß i den aldrende hjernen . I økende grad har studier vist AT NDRG2 er forbundet med aldersrelaterte lidelser som Alzheimers sykdom. I vår studie økte nivåene AV GFAP og NDRG2 mRNA i cortex, hippocampus og thalamus gradvis med alderen, mens nivåene Av s100ß mRNA i hippocampus og thalamus økte med alderen, men ikke i cortex.Vi bør merke seg at for tiden mange markører i tillegg til de vi testet, SOM ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 og vimentin, brukes til å merke astrocytter. I vår studie sammenlignet vi bare de klassiske cerebrale astrocyttene merket AV den nye foreslåtte markøren NDRG2 og de mest brukte markørene: GFAP, S100ß og gs i cerebrum.som konklusjon indikerer vår studie AT NDRG2 og S100ß er mer hensiktsmessige markører for henholdsvis astrocytter i cortex og thalamus, samt for å observere den totale fordeling og endringer i antall astrocytter gjennom cerebrum. I mellomtiden er GFAP bedre ENN NDRG2 og S100ß når man merker prosesser og grener av astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og spesielt hippocampus. Vår studie viser viktigheten av å velge den mest hensiktsmessige markøren for astrocytter i forskjellige mus cerebrale regioner, som gir veiledning for nevrovitenskapsforskere når de utforsker astrocytiske funksjoner.

Datatilgjengelighet

dataene som brukes til å støtte funnene i denne studien, er inkludert i artikkelen.

Avsløring

Zengli Zhang Og Zhi Ma er medforfatterne.

Interessekonflikter

forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Forfatteres Bidrag

Zengli Zhang og Zhi Ma bidro like mye til denne studien.

Takk

dette arbeidet ble støttet Av Beijing Natural Science Foundation (no. 7194321 Til Lixia Zhang), National Natural Science Foundation Of China (no. 81801138 Til Yulong Ma, no. 81771206 Til Wangyuan Zou), Young Scholar Research Grant Av Kinesisk Anestesiolog Association (no. 21700001 Til Yulong Ma), Miaopu Foundation Of Chinese PLA sykehus (nr. 18kmm47 Til Lixia Zhang), Og Beijings Kommunale Vitenskap & Teknologikommisjon (nr. 1811000017180022 Å Henge Guo).

Supplerende Materialer

Supplerende Figur 1. Kolokalisering AV NDRG2 og GS innenfor astrocytter. Supplerende Figur 2. Uttrykket AV NDRG2 protein i cellelinjer. (Tilleggsmateriale)