Rnaser er som baddie superhelter blant laboratorieenzymer. De er allmektige, destruktive og tilsynelatende uforgjengelige.dette er fordi de ble skapt av onde overherrer, med det eneste formål å gjøre livet vanskelig for de modige forskerne som kjemper hver dag for å produsere høykvalitets, intakte RNA-preps.
Ok, jeg spøker om overlords-delen. Men hvorfor Har Rnaser alle disse superkreftene uansett? Og hva kan du gjøre for å beseire dem? La oss finne det ut.
Supermaktene Til Rnaser, forklart.
Rnaser er Allmektige
dette er sant. Rnaser finnes i alle celletyper og organismer fra prokaryoter til eukaryoter. dvs. de er overalt. Dette er en av hovedgrunnene til at de er et slikt problem i laboratoriet. De flyter i luften, på alle overflater av kroppen din. Det betyr at de forurenser alt som luften eller overflaten av kroppen din har rørt. Som er i utgangspunktet alt. Også, rnase a spesielt adsorberer veldig sterkt til glass, noe som gjør det enda tøffere å fjerne det fra flasker etc.
Rnaser Er Svært Destruktive
Rnaser har generelt en meget høy spesifikk aktivitet mot deres substrat (RNA). Dette betyr at den minste mengden RNase lett kan rive gjennom dine dyrebare RNA-preps. Forresten er dette også en av grunnene til at En RNase (RNase A) var det første enzymet som hadde sin katalysemekanisme utledet (Findlay et al 1962).Convential visdom sier at Hvis du autoklaver Rnaser, de denaturerer, men deretter renatur og re-få delvis funksjon etter avkjøling. Denne fantastiske, sagnomsuste heltemot er aktivert av en rekke intramolekylære disulfidbindinger som holder strukturen intakt, selv etter at hydrogenbindingene som normalt holder 3d-proteinstrukturen på plass, er brutt. Som alle fabler er dette sant til en viss grad. Men les videre og vi vil finne ut at denne supermakt har blitt hyped opp av spin doctors På RNase Baddies Inc.
SELV EDTA kan ikke stoppe dem!I Motsetning til andre nukleaser, krever mange rnaser ikke metallioner for katalyse siden de bruker 2-prime hydroksylgruppen AV RNA-substratet som en reaktiv art, slik at det bare å legge TIL TE ikke hemmer DEM, som DET ville for DNA-gumlende nukleaser.
Hvordan å beseire den onde RNases
ikke bekymre deg, stipendiat forsker. Rnaser kan v re formidable fiender, men de har svakheter som vi kan utnytte.
Spark dem i H ‘ s
rnaser stole på histidinrester i deres aktive sted for katalyse. Så dietylpyrokarbonat (DEPC), som er et histidinspesifikt alkyleringsmiddel, kan inaktivere dem. Autoklavering vil da fjerne DEPC for å stoppe det fra å alkalisere andre proteiner i deg eller dine prøver.Autoklavering virker, i en grad
den mye sagnomsuste indestructibility Av Rnaser i møte med autoklavering er sant i kjernen, men også veldig overhypet,som jeg nevnte ovenfor. En fin liten studie fra Ambion viste At Rnaser (eller RNase A i det minste) ikke er helt motstandsdyktige mot autoklavering. Snarere er deres aktivitet decimert ved autoklavering, men en liten del Av RNase-aktiviteten forblir etter autoklavering.
Men hvis selvfølgelig en liten mengde RNAse fortsatt har mye RNA munching power. Dette betyr at rutinemessig autoklavering som en del av rnase-dekontamineringsprosedyrene dine er absolutt verdt – det er bare at du ikke kan stole på det for å fjerne all aktivitet.Mens våt varme (autoklavering) delvis ødelegger Rnaser, er det ikke noe håp om at de tåler tørr varme. Tørr varme oksiderer Rnaser-noe annet protein, uansett hvor robust de er. Så for å rengjøre glasset ditt, bør et par timer på 180 degC gjøre det.Kjemisk krigføring For rengjøring av overflater, Rnaser, så robuste som de er, kan ikke stå ting som hydrogenperoksid, sterke syrer/ baser, Trizol etc. Disse er alle ofte brukt til å kvitte seg med selv de tøffeste Rnasene.
Kryptonitt for Rnaser: Inhibitorer
Kanskje det beste våpenet vi har i vår armory mot Rnaser er Rnasehemmere. Vanligvis er kommersielle rnasehemmere versjoner av placenta ribonukleaseinhibitor (RI). Som noen som tilbringer et år, prøver å perfeksjonere RNA in situ hybridiseringer uten hjelp av En rnasehemmer (på grunn av en falsk økonomi av sjefen min!), Jeg vet bare hvor bra Denne Rnase Kryptonitt er. En mikroliter RI og plutselig begynte mine eksperimenter å fungere.jeg sier at dette er det beste våpenet i vår armory mot Rnaser fordi I motsetning til alle de andre løsningene som er nevnt ovenfor, Er Rnasehemmere spesifikke, slik at du (generelt) kan sette dem akkurat der det teller i arbeidsflyten din og få den beskyttelsen du trenger fra de onde. IKKE vær uten disse tingene hvis du jobber med RNA.
har dette hjulpet deg? Vennligst del med nettverket ditt.