DISKUSJON
Våre resultater viser At Ved nøye planlegging, opplæring og standardisering av reagenser og protokoller har et transnasjonalt laboratorienettverk kapasitet til å produsere konsistente og sammenlignbare HAI-analyseresultater. DE fem folkehelse-og akademiske laboratoriene som deltok i denne studien var EN DEL AV PCIRN, som ble utviklet for å øke Canadas nasjonale kapasitet til å støtte vaksine og annen influensaforskning i tilfelle en pandemi. I en pandemisk situasjon, med høyt volum, høyt trykk og geografisk spredt influensatesting, vil standardisering av HAI-analysen være av avgjørende betydning for å sikre sammenlignbarhet av resultater mellom laboratorier. PCIRN-laboratoriene viste en høy standard for reproduserbarhet i laboratoriet, med 99,8% presisjon av duplikater (99.2% til 100% per laboratorium), 97,8% av titere innenfor et 2-gangers område over gjentatte analysedager (93,3% til 100% per laboratorium), og 91,1% av testseraen som viser titergjengelighet over hver enkelt gjentakelse av seks-analyseprotokollen (60% til 100% per laboratorium). Interlaboratory reproduserbarhet var også høy, med median titere på tvers av alle replikater fra de fire nonreference laboratorier innen 2 ganger av referanselaboratoriet for 100% av sera testet. På en per-laboratorium basis, titrene på 94,3% og 98.9% av prøvene kvantifisert i en enkelt fortynning av referanselaboratoriet og konsensustitere, henholdsvis (områder, 85% til 100% og 95% til 100%). Disse prosentene oppfyller typiske akseptable terskler for HAI-analysevariabilitet(dvs. at minst 80% av prøvene er innenfor 1 fortynning av nominelle verdier og / eller All-assay Gmt). HAI-analysespesifisitet (100%) og sensitivitet (87,5% til 100%) på TVERS AV PCIRN-laboratorier var tilsvarende godt innenfor akseptkriteriene i tidligere studier (dvs., 100% av negative prøver skal kvantifisere som under kvantitasjonsnivåer, og minst 80% av positive prøver skal kvantifisere som positive ).
for intralaboratoriekomponenten i HAI-analysevariabilitet, ser repeterbarheten i PCIRN-laboratorier ut som den som er vist i andre studier (5, 22). En advarsel av disse tidligere studiene var at ikke mer enn tre gjentakelser ble undersøkt, til tross for vanlige immunanalysevalideringspraksis ved å undersøke seks eller flere gjentatte analyser (24-27). Som sådan er det ikke klart om deres data er direkte sammenlignbare med resultatene bestemt over seks analyser i denne studien. Likevel synes vårt funn av 0% til 6,7% (median, 0%) av analysene med resultater som avviker mer enn 2 ganger fra andre analyserepetisjoner, å være sammenlignbare med 4,8% til 7,1% nevnt tidligere i ett laboratorium (22) og 0% til 15% (median, 2%) i ni laboratorier (5).Våre funn av høy HAI titer reproduserbarhet mellom geografisk spredte PCIRN laboratorier kontrast med tidligere rapporter som viser betydelig variasjon mellom internasjonale laboratorier utfører denne analysen (5, 6, 9-12). For eksempel fant data fra en stor samarbeidsstudie (11 laboratorier) Per prøve Gcver fra 84% til 803% (median GCV per virus på 138%, 155% og 261% ). Andre studier rapporterte Gcver FOR h1n1-og H5N1-prøver som strakte seg 95% til 345% (11) og 22% til 582% (6), Og Gmt varierte mellom laboratorier med opptil 80 ganger (11) eller 128 ganger (9). Mens tidligere rapporter ofte inkluderte høyere antall deltakende laboratorier enn den nåværende studien, selv om bare seks laboratorier bidro med data, var median interlaboratory GCV 83% for fem H1N1-prøver, med 80% av dem som oversteg en 4 ganger forskjell mellom laboratorier (11). I kontrast viste den nåværende studien median Gcver per virus på bare 39% og 17%, med 95% av prøvene innenfor en 4-ganger forskjell mellom laboratorier. En prøve oversteg 4 ganger forskjellen; titer var ikke kvantifiserbar for denne prøven på ett laboratorium, og dermed den laveste verdien ble tildelt i stedet for målt. Hvis denne prøven ble utelatt fra analyser, ville maksimal GCV være 75,5%, noe som ville representere en verdi lavere enn minimum GCV i andre studier. Selv om denne prøven viste høyere variabilitet enn andre, viste dette lave måleområdet generelt mindre presis enn høyere områder. FOR eksempel varierte GCV fra 43,4% til 156,4% ved titere mellom 10 og 80 sammenlignet med 11,1% til 53,1% ved høyere titere (Fig. 3). Større variabilitet med lavere titerprøver har også tidligere blitt beskrevet (23) og bidro sannsynligvis til inkongruente seroproteksjonsklassifiseringer i den nåværende studien for de tre H1N1-prøvene med titere nærmest terskelen til 40 (konsensustitere på 22, 24 og 43). Til tross for dette forblir diagnostisk nøyaktighet av seroproteksjon på TVERS AV PCIRN-laboratorier generelt høy (93,6% når konsensustitere ble brukt til å definere seroproteksjon og 89,5% sammenlignet med referanselaboratorieverdier).
høy enighet om INTERLABORATORY HAI titere I PCIRN laboratorier kan forholde seg til nøye harmonisering AV HAI analyse prosedyrer og reagenser på TVERS AV PCIRN. Deltakere i tidligere studier som viste høy interlaboratorievariabilitet brukte VANLIGVIS HAI-analysemetoder som varierte mellom laboratorier. Analysevariabler som antas å bidra til variabilitet i resultatene inkluderte mengden virus tilsatt, viruskultursystemet (f. eks., embryonerte kyllingegg versus vevskultur), varigheten AV rde-behandling, den første serumfortynningen, type og alder av rbc som brukes, og tiden tillatt FOR rbc-sedimentering (5, 11, 12). Overraskende, men Når Wood et al. gitt kommersielle og offentlige laboratoriedeltakere involvert i sesonginfluensavaksinetesting I Europa med en detaljert standard operasjonsprosedyre som skal følges og vanlige reagenser / materialer, rapporterte de at interlaboratorievariasjon ikke ble signifikant forbedret (10). Forfatterne spekulerte på at vedvarende «lokale tekniske variasjoner», så vel som forskjellige rbc-leverandører, kunne ha påvirket reproduserbarheten mellom laboratorier, men bemerket at ytterligere standardisering var utenfor grensene for muligheten for studien. Senere publikasjoner tolket disse funnene som indikerer AT HAI-analysestandardisering mellom laboratorier generelt ikke er en mulig tilnærming for å harmonisere HAI-resultater på tvers av forskjellige laboratorier (8, 12), og minst en gruppe har forsøkt å utvikle en modifisert OG mer robust HAI-analyse for å generere mer pålitelige og reproduserbare data (22).
I den nåværende studien fulgte PCIRN laboratoriene strengt til STANDARD, offentlig tilgjengelig VERDENS Helseorganisasjon HAI assay protokoll, der punkter som var underlagt tekniske eller fortolkende variasjoner ble harmonisert mellom laboratorier før studiestart. Nøkkelreagenser (F. eks. RDE, RBC, viruslagre) ble hentet fra de samme leverandørene så mye som mulig. I tillegg begrenser testingen til en enkelt teknolog på hvert teststed økt standardisering. Den mulige effekten av å bruke flere personell ved hvert laboratorium ble ikke testet i denne studien. Mens bruken av flere operatører potensielt kan øke variabiliteten, viste den eneste studien som undersøkte denne muligheten for HAI-testing, ingen signifikant forskjell mellom resultatene fra to operatører i samme laboratorium (22).Potensielle variasjoner mellom laboratorier i virusstammer dyrket for bruk i analysen ble minimert MELLOM PCIRN-laboratorier ved å bruke virale frøbestander fra en enkelt kilde som ble dyrket i samme cellelinje under lignende forhold i alle laboratorier. Vi spekulerer i at interlaboratory reproduserbarhet kan være mottagelig for ytterligere forbedringer var viral arbeider aksjer som skal produseres sentralt og distribuert til deltakende laboratorier. Betydningen av variasjoner i virusstammen for HAI – endepunkttitere illustreres godt av de 2 til 3 ganger lavere titrene som ble vist i en studie da HAI-analysen brukte en a / Cal pH1N1-stamme sammenlignet MED X179A reassortant som fortsatt hadde tilsvarende hemagglutininer og neuraminidaser (11). Dessverre ble ikke bestandene sekvensert som en del av denne studien, og vi kan derfor ikke verifisere at alle laboratorier brukte virus med identiske hemagglutininsekvenser. Selv om mindre sekvensvariasjoner hadde blitt introdusert ved lokal forplantning av virusbestander, var variabiliteten mellom laboratorier i denne studien liten, og det er derfor vanskelig å forestille seg hvordan bruken av aksjer med identiske HA-sekvenser kunne redusere variabiliteten ytterligere. Selv om forskjellene ikke oversteg 2 ganger i dette lille prøvesettet, kan mindre variasjoner I HA-sekvensen introdusert ved lokal forplantning av virale bestander være en mulig forklaring på trender for undervurdering AV H1N1-titere og overestimering AV H3N2-titere.Ulike studier har rapportert redusert interlaboratorievariabilitet i HAI-titere ved å kalibrere resultater mot internasjonale standarder (6, 11-13); imidlertid eksisterer slike standarder ikke for dagens sesonginfluensa B OG influensa A H3N2-virusstammer, og den konstante antigeniske driften av sesongstammer som driver årlig reformulering av vaksinene, kan godt kreve kontinuerlig utvikling og validering av nye standarder. I denne studien, interlaboratory sammenlignbarhet synes overlegen som oppnås gjennom bruk av selv de mest effektive kalibreringsstandarder. For eksempel, etter kalibrering MED ER 09/194, Wood et al. (11) rapporterte at maksimale forskjeller mellom Gmt ved forskjellige laboratorier ble redusert fra 80 ganger til 64 ganger (dvs.en verdi fortsatt betydelig høyere enn den maksimale 11 ganger i den nåværende studien) og at gcv-områdene mellom laboratorier ble redusert fra 95% til 345% (median, 105%) til 34% til 231% (median, 109%)—dvs. godt over området 0% til 156% (median, 27%) sett i denne studien. Tilsvarende er bruken av erstatning 10/202 redusert GCV mellom laboratorier fra et område på 108% til 157% til et område på 24% til 144% over fem prøver og maksimale forskjeller mellom laboratorier fra 43 ganger til 21 ganger (13), og ved hjelp av 07/150-standarden, Stephenson et al. (6) reduserte median GCV på 15 NIBRG – 14 H5N1 clade 1 prøver fra 125% (område, 31% til 582%) til 61% (34% til 535%).Mens den eksakte årsaken(e) til det høye nivået av avtale MELLOM PCIRN laboratoriene i forhold til tidligere studier ikke kan fastslås, ble vår suksess lettet av det incitamentet vi hadde som et nasjonalt nettverk for å jobbe mot det felles målet om å etablere reproduserbare prosesser. Detaljert og streng prosess-og reagensharmonisering mellom steder er kanskje det eneste » nye » aspektet vi tok med i denne studien, sammenlignet med den langvarige litteraturen som viser dårlig HAI-reproduserbarhet mellom laboratorier. Våre data tyder imidlertid på at med forsiktig standardisering kan interlaboratorievariasjoner i HAI-titere reduseres til nivåer som ligner de som observeres i enkeltlaboratorier. Potensielle neste skritt i å minimere variasjoner I HAI titere i laboratorier over hele verden ville være mobilisering av nettverk/konsortier, implementering av retningslinjer og / eller regulatoriske krav til bruk av standardprosedyrer og reagenser, standardisert opplæring for å sikre reproduserbarhet, og levering av støtte og / eller insentiver for laboratoriene å omfavne» standardisering » konseptet.