Sulfatreduserende bakterier i avføring hos mennesker og deres tilknytning til inflammatoriske tarmsykdommer

2.2 SRB deteksjon og opptelling

Ett gram avføring ble blandet med 4 ml fosfatbufret saltvannsbuffer og sentrifugert (3000 rpm, 5 min). En milliliter supernatant ble inokulert umiddelbart i et flytende medium (Test-sett Labège@ge, Compagnie Franupunaise de Gé, Oré, Frankrike) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt består Testsettene Labè® av hetteglass som inneholder 9 ml av et spesifikt medium (organiske forbindelser: laktat og acetat, reduksjonsmiddel: titansitrat) anaerobt betinget FOR SRB-deteksjon. Det er inokulert med en sprøyte gjennom en gummihett. Dette limpide og fargeløse mediet er opprinnelig utviklet for påvisning AV SRB fra miljøprøver. Det ble sammenlignet Med Det Vanlig brukte Postgates faste medium E (organisk forbindelse: laktat, reduksjonsmidler: askorbinsyre og tioglykolsyre), inokulert parallelt under anaerob atmosfære. SRB ble oppregnet ved hjelp av lange og smale rør fylt opp med sistnevnte medium og inokulert med desimalfortynninger av avføringen. Alle inokulerte medier ble inkubert ved 37°C i 2 måneder. TILSTEDEVÆRELSEN AV SRB ble fastslått ved dannelsen av et svart bunnfall (jernholdig sulfid) i flytende medier og ved utseendet av svarte kolonier i faste medier.

2.3 Design AV PCR primere

16s rDNA sekvenser Av Desulfomonas og Desulfovibrio stammer tilgjengelig I GenBank database ble sammenlignet ved Hjelp Av Sequence Navigator programvare, versjon 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Bergen, NORWAY). Det er tillatt å designe seks primere for identifisering AV PCR AV SRB tidligere isolert fra mennesker , relatert henholdsvis Til D. piger (tidligere Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 Atcc 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, og d. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 OG D. DESULFURICANS MB ble differensiert som 16s rDNA sekvenser av disse stammene viser en forskjell på 3%. Primerne var 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG A-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GGT AAT CAG CGT CGT AC-3′), Rettferdig-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Gris-F (5′-cta GGG TGT TCT AAT KATT KATT CCT AC-3′), OG P687-R (5′-GAT ATC TAC GGA TTT CAC TCC TAC ACC-3′) (Tabell 2). Spesifisiteten av disse primere ble sjekket på alle bakterielle sekvenser tilgjengelig Fra GenBank database Ved Hjelp Av Blast program, versjon 2.0 (National Center For Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. Desulfuricans Essex 6, to stammer relatert Til D. desulfuricans MB og åtte stammer identifisert Som d. fairfieldensis) ble brukt som positive kontroller. Sensitiviteten TIL PCR ble evaluert med fortynninger av kvantifiserte bakteriestammesuspensjoner. Spesifisiteten TIL PCR ble kontrollert med negative kontroller inkludert typestammer (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) og vanlige intestinale kliniske stammer tilhørende følgende arter: Bacteroides sprø, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniform, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, bakterier ufarlig, Enterobacter romerriket, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, eubacterium liten, Eubacterium klebrig, Fusobacterium nucleatum, København av kanalen, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii staphylococcus Aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, staphylococcus aureus, staphylococcus Epidermidis Streptococcus bovis.

ved slutten av inkubasjonstiden ble Alle De 151 inokulerte testsettene Labège® sjekket ved bruk AV multiplex PCR. DNA-ekstrakter ble hentet fra 500 µ kulturmedier, etter sentrifugering og resuspensjon I te-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Kort sagt ble cellene lysert ved bruk av suksessivt lysozym (3 mg ml-1), SDS (1%, w/v) og proteinase K (0,25 mg ml−1). ETTER en inkubasjon over natten ved 37°C ble DNA ekstrahert ved standard fenol / kloroform / isoamylalkohol-metoden. Hver 50-µ PCR-blanding inneholdt 5 µ dna–ekstrakt (omtrent 50 ng DNA) og endelige mengder 0,4 µ av hver primer, 0,8 mM av hver Deoksynukleosidtrifosfat (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Tyskland), 0,4 mM Tris-HCl-buffer, 1,5 mM MgCl2 Og 1,5 E av TAQ DNA-polymerase (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, STORBRITANNIA). Alle reaksjoner ble utført ved Bruk Av GeneAmp PCR-Systemet 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Et innledende denatureringstrinn på 94 hryvnias C i 4 minutter ble etterfulgt av 30 sykluser med denaturering (94°C, 1 minutt), gløding (55 hryvnias C, 1 minutt) og utvidelse (72°C, 2 minutter) og med en endelig utvidelse (72 hryvnias C, 5 minutter). Negativ (vann i stedet FOR DNA ekstrakt) og positiv (d. fairfieldensis DNA ekstrakt) kontroller ble inkludert i hvert løp. Forsterkede produkter ble løst ved elektroforese i 1,5% (w/v) agarose geler inneholdende etidiumbromid (1,6 mg ml−1). EN 100 bp DNA stige ble brukt som en størrelse markør (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, d. desulfuricans Essex 6, D. DESULFURIKANER MB og d. fairfieldensis ble identifisert med henholdsvis 255 -, 255 -, 396-og 534-bp-bånd. D. piger og D. desulfuricans Essex 6 ble ytterligere differensiert ved separate PCR-analyser ved hjelp av deres respektive spesifikke primere. For negative prøver ble 16s rDNA-forsterkning ved bruk av konsensusprimerne 27f og 1525r utført for å kontrollere fraværet Av inhibering Av Pcr-ene ved forurensninger.

3 Resultater

3.1 SRB-deteksjon og opplisting

hos friske individer og I henhold til kriteriene ovenfor ble SRB funnet i 10 feces (24%) med Både Test-Kit Labège® og Postgates medium. HOS pasienter Fra Hepato-Gastro-Enterologisk Enhet ble SRB dyrket fra 42 feces ved Bruk Av Postgates medium. Ytterligere tre prøver ble funnet positive med Testsettet Lab@ge®. Dermed ble BLANT DE 110 pasientene som ble studert, OPPDAGET SRB ved kultur hos 45 pasienter (41%). Ytterligere tre prøver ga tvetydige resultater med Testsettet Labège® (tilstedeværelse av et mørkt brunt bunnfall). Gjennomsnittlig tid for påvisning AV VEKST for SRB var henholdsvis 2 og 6 dager ved bruk av Test-kit Labè® (område 1-11 dager) og Postgates medium (område 3-39 dager). Gjennomsnittlig TELLING AV SRB i feces hos friske individer og pasienter var 105 g-1 (område 102-109 g-1). DERMED VAR SRB-telling ikke relatert til pasientens kliniske status.

3.2 SRB-identifikasjon ved multiplex PCR

følsomheten til multiplex PCR-analysen var 100 bakterier per ml. Dens spesifisitet ble fastslått ved fravær av kryssreaksjoner mellom de fire genoartene differensiert. Hver positiv kontroll ble funnet positiv utelukkende med det tilsvarende settet av primere. Alle stammer som ble brukt som negative kontroller for å sjekke spesifisiteten, inkludert typen stammer Av d. gigas og d. vulgaris, ga negative resultater med de fire primersettene. Specificiteten av reaksjonene ble ytterligere bekreftet ved sekvensering av de forsterkede produktene. De oppnådde sekvensene samsvarer alltid med de forventede. FOR SRB-negative prøver AV PCR, 16s rDNA forsterkning tillatt å forkaste muligheten for en hemming Av Pcr av forurensninger.

hos Pasienter Fra Hepato-Gastro-Enterologisk Enhet ga DE 45 positive og de tre tvetydige feces positive RESULTATER VED PCR. De tilsvarte D. piger (n=33) , d. fairfieldensis (n=14) eller begge (n=1). Ingen d. desulfurikaner ble påvist (Tabell 3). De kultur-negative kolber var også negative VED PCR.

3.3 Forholdet Mellom Desulfovibrio-arter og IBD

fordelingen av arten var ikke signifikant forskjellig når man sammenlignet friske individer og pasienter med ikke-inflammatoriske tarmsykdommer. D. piger var knapt mer utbredt Enn d. fairfieldensis. Omvendt, Hos PASIENTER MED IBD, Var d. piger 4 ganger hyppigere Enn d. fairfieldensis. Denne forskjellen var spesielt merkbar FOR CD, DA IBD-pasienter hovedsakelig besto AV CD-pasienter. Videre er forekomsten Av D. piger var signifikant høyere hos PASIENTER innlagt PÅ IBD sammenlignet med friske personer eller pasienter innlagt på sykehus for andre patologier(P < 0,05). Det var ingen sammenheng mellom sykdomsstadiet og TILSTEDEVÆRELSEN AV SRB. Terapi endret ikke isolasjonshastigheten til disse bakteriene.

4 Diskusjon

TILSTEDEVÆRELSEN AV SRB i tarmkanalen hos dyr og mennesker har blitt anerkjent i lang tid, selv om identifikasjoner på artsnivå sjelden har blitt utført. Våre resultater bekrefter at disse bakteriene er vanlige innbyggere i tarmkanalen hos mennesker. De fleste STUDIER av INTESTINAL SRB fra IBD-pasienter har basert seg på dyrkningsbasert mikrobiologisk analyse av fekale prøver, og har derfor identifisert SRB på slektsnivå . Nyere studier har imidlertid antydet at SRBS mulige rolle i patogenesen av IBD kan være relatert til fysiologiske og / eller fylogenetiske forskjeller mellom SRB-stammer . Dermed utviklet vi en multiplex PCR for å identifisere disse bakteriene på artsnivå. Med tanke på vanskeligheten med isolasjon og sjeldenhet av spesifikke søk, er forekomsten AV SRB i humane kliniske prøver absolutt undervurdert. Testsettet Labège®, utviklet for påvisning AV SRB fra miljøprøver, viste seg å være et egnet medium for påvisning AV SRB fra avføring så vel som fra kroppsvæsker (Loubinoux, upublisert resultat). Det har blitt vist av produsenten å vokse miljøstammer AV SRB som D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034T Og Desulfobulbus propionicus DSM 2032T. I våre hender viste Det seg å være mer følsomt Enn Det Vanlige Postgatemediet, da seks ekstra isolater Av Desulfovibrio ble påvist hos pasienter. Til tross for den store ledsagende floraen, tillot Test-kit Labè® RASK vekst AV SRB fra avføringsprøver, da gjennomsnittlig detekteringstid var 2 dager(versus 6 dager I Postgates medium). Dette kan være relatert til mediumets kvalitet, men også til modusen for inokulering av prøver som sikrer vedlikehold av streng anaerobiose. Sammenlignet Med Postgates medium, utvider tilsetningen av acetat til laktat deteksjonsspekteret til å omfatte langsomt voksende ACETATMETABOLISERENDE SRB som Desulfobacter spp. Dessuten gir tilstedeværelsen av titancitrat, som er et svært effektivt reduksjonsmiddel (redokspotensialet til Test-kit Labège® ca.-600 mV), en raskere påvisning av DE fleste SRB-stammer.

det er mulig at NOEN STAMMER AV SRB ikke ble oppdaget av Testsettene Labège®, overgrodd av den medfølgende floraen eller på grunn av lavt antall prøver. Imidlertid er Test-kit Labège® tilpasset veksten til DE fleste SRB, og ALLE DE positive kolber ble identifisert AV PCR som D. piger, d. fairfieldensis eller D. desulfuricans. Til tross for inkubasjonstiden på 2 måneder ble det ikke påvist flere arter. Dermed er det mulig at våre funn samsvarer med den virkelige menneskelige flora som nesten utelukkende består Av D. piger og d. fairfieldensis. D. desulfurikaner ble isolert en gang og har også blitt beskrevet hos mennesker i en tidligere studie, men det er sannsynligvis uvanlig i tarmkanalen. I de fleste tilfeller, d. piger Og D. fairfieldensis var gjensidig utelukkende. En forening av begge arter ble observert bare en gang i tilfelle av kolonkreft. FOR å bekrefte Den nesten ikke-overlappende forekomsten Av D. piger og d. fairfieldensis, har fem kolonier AV SRB dyrket I fast Postgates medium blitt identifisert AV PCR for hver Positive Testsett Labège®. I hvert tilfelle ble det samme resultatet oppnådd, og de fem koloniene tilhørte samme art (data ikke vist). Vi har også fulgt opp 10 pasienter (fem SRB-positive og fem SRB-negative) i 2 måneder og avføring ble dyrket hver uke. For hver pasient ble det samme resultatet (SRB-positivt eller SRB-negativt) oppnådd med alle prøver (data ikke vist). Det ville imidlertid være interessant å følge PASIENTENE MED IBD over en lengre periode for å avgjøre om sykdommens aktivitet har en konsekvens på BEFOLKNINGEN I SRB.D. desulfuricans er vanligvis isolert fra miljøet, og har også vært ansett som den mest utbredte arten Av Desulfovibrio hos mennesker til den siste beskrivelsen Av d. fairfieldensis. Dermed kan man bli overrasket over den svært lave forekomsten Av D. desulfurikaner i vår befolkning. Hittil Har D. piger og d. fairfieldensis blitt isolert utelukkende fra menneskelige prøver. Dermed viser våre resultater at begge arter kan være spesifikke for den menneskelige tarmkanalen. Dette gjenstår imidlertid å bli bestemt av det spesifikke søket etter disse bakteriene i andre økologiske nisjer. D. piger har blitt beskrevet bare en gang, og ble ansett som et uvanlig funn hos mennesker. Våre resultater indikerer at DET kan være den vanligste SRB i tarmkanalen. Denne arten har imidlertid aldri blitt beskrevet i smittsomme prosesser. Tvert Imot, D. fairfieldensis, tilsynelatende mindre vanlig i menneskelig avføring, har blitt isolert utenfor kolon lumen fra blod og septisk samlinger . Dermed kan d. fairfieldensis ha ytterligere invasive egenskaper sammenlignet med Andre Arter Av Desulfovibrio, noe som vil forklare utvinningen fra kliniske prøver. Interessant, i vår serie av pasienter, er forekomsten Av d. piger i avføring betydelig høyere hos pasienter innlagt PÅ IBD (for DET meste CD) enn hos friske personer eller hos pasienter innlagt på andre patologier. Dette kan ha to forklaringer: enten D. piger har fysiologiske egenskaper som forårsaker lesjoner og / eller deltar i vedvarende kroniske inflammatoriske prosesser, eller kolonisering av denne arten favoriseres av lokale forhold hos IBD-pasienter. Foreningen AV SRB MED IBD er allerede beskrevet . D. piger har ikke blitt vurdert videre siden sin første beskrivelse i 1976 . Dermed er funnet at denne bakterien, betraktet som en ‘ikke-patogen’ art, en vanlig innbygger i den menneskelige tarmkanalen, og den mest utbredte ARTEN AV SRB hos IBD-pasienter, overraskende. Ytterligere studier bør utføres for å belyse hvordan D. piger kan være involvert i disse kroniske inflammatoriske prosessene.

Anerkjennelser

dette arbeidet ble delvis støttet av Compagnie Fran@aise De Gé (Orlé, Frankrike) Og AV EN FCT-Tildeling POCTI 36562 / ESP / 2000 TIL ICP. Vi står i gjeld til den avdøde Dr. Wee Tee (University Of Melbourne, Australia) for vennlig å gi fire stammer av d. fairfieldensis (inkludert stamme ATCC 700045) og Også Til Prof. D. Raoult (Universitetet I Marseille, Frankrike) for å gi en stamme Av d. fairfieldensis. Vi takker D. Meng Og AM Carpentier (Laboratoire De Bacté-VIROLOGIE UMR CNRS 7565) For deres utmerkede tekniske assistanse, Dr. A. Dao og Prof. B. Fortier for å gi avføring fra friske personer, samt sykepleierne Til Hepato-Gastro-Enterology-Enheten for deres vennlighet.