Virkningsmekanismer Av Du-Huo-Ji-Sheng-Tang På Brusk Degradering i En Kanin Modell Av Slitasjegikt

Abstract

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) er en tradisjonell Kinesisk urtemedisin som brukes til å behandle slitasjegikt. I denne studien ble den terapeutiske effekten AV DHJST på bruskforringelse i en kaninmodell av slitasjegikt undersøkt. I kneleddene hos kaniner ble fremre korsbåndstranseksjon (ACLT) utført for å indusere eksperimentell slitasjegikt. Ved slutten av den sjette uken ble 30 kaniner med ACLT delt inn i seks grupper, kontrollgruppe, DHJST-gruppe og Osaminethacingruppe (OSA), som ble fulgt i ytterligere 4 uker. De andre tre gruppene av kaniner med ACLT ble ubehandlet MED DHJST ELLER OSA, som ble ofret etter 6 uker, og fungerte som 6-ukers tidspoengkontroller. Resultatene indikerte at ved slutten av den sjette uken etter operasjonen var det en signifikant histologisk degenerasjon i kontrollgruppen sammenlignet med den normale gruppen. I kontrollgruppen var gjennomsnittlig score for histologisk degenerasjon ytterligere økning ved uke 10, og det var en signifikant lavere gjennomsnittlig score for histologisk degenerasjon i DHJST-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. For å undersøke den potensielle mekanismen ble uttrykksnivået FOR VEGF og HIF-1Α påvist. Uttrykket FOR VEGF mRNA og HIF-1Α mrna er lavt i normalgruppen, mens aktiviteten øker gradvis i kontrollgruppen. Sammenlignet med samme modellgruppe, ble IMIDLERTID AKTIVITETEN TIL VEGF og HIF-1Α betydelig redusert i DHJST-gruppen. SOM konklusjon har DHJST signifikant terapeutisk effekt på osteoartritt-kaniner, og mekanismer er forbundet med hemming AV VEGF-og HIF-1Α-uttrykk.

1. Innledning

Artrose (OA) Er en progressiv og ødeleggende sykdom som kan ta år å klinisk manifest i berørte individer. Brusk aldring og kondrocyt senescens spiller en viktig rolle i patogenesen og utviklingen AV OA. Under utviklingen AV OA er det ofte en fokal økning i celledød. Mange rapporter viste at kondrocyt senescens bidrar til risikoen for bruskdegenerasjon ved å redusere kondrocytens evne til å opprettholde og reparere leddbruskvevet . Siden det er teoretisert at hver kondrocyt er ansvarlig for vedlikehold av den ekstracellulære matrisen som omgir den, og at matriksmolekyler produsert i en region av vevet har en svært begrenset evne til å krysse vevet, kan fokaltapet av levedyktige celler være delvis ansvarlig for vevets manglende evne til å reparere mindre skade .

Foreløpig er DET ikke en kur FOR OA, og tilgjengelige behandlinger bare bremse utviklingen av sykdommen . I de siste 20 årene Har Tradisjonell Kinesisk Medisin (TCM) sett betydelig fremgang mot OA, som for eksempel å forbedre pasientens kliniske funn, hemme inflammatorisk reaksjon og bruskdegenerasjon . In vivo og in vitro studie viste også At Kinesiske urter formelen er av flere omfattende handlinger mot OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, som består Av Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi Og Poria, har vært mye brukt for behandling AV OA. Det kan forbedre kliniske symptomer, knefunksjon og livskvalitet for pasienter . Basert på vår kunnskap om oa-patogenesen i TCM, undersøkte vi EFFEKTEN AV DHJST på å forhindre bruskdegenerasjon AV OA hos kaniner og observerte mekanismene.

2. Metoder

2.1. Materialer

Blindvei kolorimetrisk apoptose deteksjonssystem (TUNEL assay) ble hentet Fra Nanjing Jiancheng Biotech Company (Kina). Trizol total RNA ekstraksjon kit, DNA molekylær markør, SYBR Premix EX TaqTM Og Perfekt Sanntid kit ble kjøpt fra Invitrogen Co. (USA). Urter I DJST (består Av Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi Og Poria, levert Av Shanghai Huayu Kinesiske Urter Co. Ltd., Kina) ble akkreditert av en farmakognosist i henhold til standardprotokoller, utarbeidet Av Shanghai Municipal Hospital Of Traditional Chinese Medicine, komponentene ble blandet i rekkefølge med forholdet mellom 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (tørrvekt) ble stoffene ekstrahert med standardmetoder i Henhold Til Kinesisk Pharmacopoeia (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Disse råmedisinene ble gjennomvåt i destillert vann og kokt i 30 min to ganger, og legemiddeloppløsningen ble filtrert gjennom et nett, deretter ble filtratet konsentrert til 4 g mL-1 av en vakuumpumpe og deretter lagret ved -20°C til bruk. Osaminetacin (OSA), hver tablett inneholder 25 mg indometacin og 75 mg aminoglukose (levert Av Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Kina), ble brukt som positiv kontrollmedisin.

2.2. Kaniner og Vev Forberedelse

Førtiåtte måneder Gamle New Zealand hvite kaniner ble levert Av Experimental Animal Center Til Kinesisk Vitenskapsakademi. Tretti kaniner gjennomgikk ensidig fremre korsbåndstranseksjon (ACLT) under generell anestesi. De normale kaniner gjennomgikk ikke en prosedyre.

ved slutten av den sjette uken ble 30 kaniner MED ACLT delt inn i seks grupper, kontrollgruppe, DHJST-gruppe og OSA-gruppe, som ble fulgt i ytterligere 4 uker. De andre tre gruppene av kaniner med ACLT ble ubehandlet MED DHJST ELLER OSA, som ble ofret etter 6 uker, og fungerte som 6-ukers tidspoengkontroller. Dekoksjonene ble oralt administrert ved dosering 0.923 g (kg-1·d-1) i 4 uker ble kaniner i OSA-gruppen administrert OSA 0,09 g (kg-1·d-1) i en periode på 4 uker, modellkontrollgruppe og normalgruppe ble oralt administrert med samme volum fysiologisk saltvann.

Kaniner ble ofret for prøvetaking. Protokollen fikk godkjenning av komiteen For Dyreforsøk Ved University Medical Center, Shanghai, Kina. Kanin tibiae ble fjernet og tibia leddbrusk ble umiddelbart lagret på -80°C. Tibiae ble nøye dissekert og fjernet fra tilstøtende muskel og umiddelbart festet i 10% formalin i 24 timer. Tibiae ble deretter avkalket i 4 uker i 100 g/L etylendiamintetraeddiksyre, vasket I PBS, dehydrert gjennom en serie etanol og innebygd i paraffin på en standardisert måte for å sikre riktig orientering. Parafinvevsseksjoner (7 µ) ble kuttet på en standardisert måte. Seksjoner ble deparaffinisert for histokjemiske analyser.

2.3. Histologisk Vurdering av Brusk

Histologisk vurdering ble utført på femorotibiale ledd av kaniner i DHJST-gruppen, OSA-gruppen og kontrollgruppene. Seksjonene ble farget Med Safranin o-fast green. Disse histologiske seksjonene fra hvert sted ble evaluert ved hjelp av et modifisert mankin graderingssystem (Tabell 1) av to uavhengige, board-sertifiserte veterinærpatologer.

2.4. TUNEL Assay

H2O2-indusert apoptose ble påvist ved å utføre terminal deoksynukleotidedyltransferase-mediert dUTP nick end-merking (TUNEL) assay ved Hjelp Av En Apo-DirectTM Kit (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort etter forbehandling og eksponering FOR H2O2 ble celler høstet, vasket, fikset, permeabilisert og merket FOR DNA-trådbrudd, deretter analysert på Et Coulter Epics Elite flow cytometer (Beckman-Coulter, Miami, USA). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.

2.5. Fluorescerende Kvantitativ PCR

Totalt RNA ble ekstrahert fra 50 mg brusk i tibiae-ledd ved Bruk Av Trizol-reagens. Syntese av cDNA ble utført ved bruk av 4 µ av totalt RNA per prøve med tilfeldige primere og reagenser som finnes i Revert Aid first Streng cDNA synthesis kit. To mikro liter (2 µ) av hver prøve ble brukt til sanntids PCR i Et Rotor-Gene 2000-system (Australia). Relativ kvantifisering ble beregnet ved hjelp av delta syklus terskel () relativ kvantifisering. Terskelsyklusen () for den endogene KONTROLL CAPDH mRNA og målsignalene ble bestemt, og den relative rna-kvantifiseringen ble beregnet ved hjelp av komparativ metode der

Sekvenser av primere brukt for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(forover) og 5′-GGCCCTGGTGAGGTTGAT-3(revers) (produktlengde: 75 bp).Sekvenser av primere brukt til hypoksi-induktiv faktor-1α(HIF-1Α) er: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(forover) og 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (omvendt) (produktlengde: 107 bp).Sekvenser av primere som brukes TIL GAPDH er: 5 ‘- CCGAGGGCCCACTAAAGG-3 (fremover) og 5 ‘ – GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(omvendt) (produktlengde: 88 bp).

2.6. Statistisk Analyse

alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik (SD). Måledata ble analysert ved hjelp av en enveisanalyse av avvik (ANOVA, SPSS 11.0). Rank data ble analysert med ridit. Resultatet av P <.05 ble vurdert å være statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. ACLT-Indusert Histologisk Degenerasjon Hos Kaniner Ble Redusert med DHJST

Representative histologiske seksjoner er vist I Figur 1. På slutten av 10. uke observert vi en normal integritet av leddflaten i normal gruppe(Figur 1 (a)). I kontrollgruppen, med økt degenerasjon, var det et tap Av Safranin o-rask grønn farging som fulgte med spaltdannelse som utvidet seg til midtre og dype soner (Figur 1 (b)), Og I DHJST-gruppen var det tapt med tidlig mild fibrillering, og et tap Av Safranin o-rask grønn farging ble observert sammen med kondrocytklynging (Figur 1(c)). OSA gruppe, med tap Av Safranin o-rask grønn farging disse endringene var lik DHJST gruppe (Figur 1 (d)). Ved slutten av den sjette uken etter operasjonen var det signifikant histologiske forskjeller i kontrollgruppen sammenlignet med normalgruppen (P <.01). I kontrollgruppen var gjennomsnittlig score for Safranin o-fast grønnfarging ytterligere økninger ved 10 .uke sammenlignet med den for ved 6. uke (P <.01) (Figur 2 (a)). Ved 10. helg var det signifikante forskjeller i mankin-score mellom kontrollgruppen OG DHJST-gruppen, det var en signifikant lavere gjennomsnittlig score For Safranin o-fast green-farging i DHJST-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (P < .01) (Figur 2 (b)), og ingen statistisk signifikante forskjeller i mankin score MELLOM DHJST-gruppen OG OSA-gruppen (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Resultatene ble presentert som middel ± SD (n = 5 per gruppe) i hver kolonne. *P< .01 versus artrose kontrollgruppen i 6. uke, * * P <.01, sammenlignet med de i artrose kontrollgruppen.

3.2. DHJST Hemmet Bruskceller Apoptose

ved slutten av den sjette uken etter operasjonen var indeksen for apoptosecelle i kontrollgruppen sammenlignet med den i den normale gruppen signifikant forskjeller (P < .01). I kontrollgruppen var indeksen for apoptosecelle fortsatt kraftig økt (fra gjennomsnittlig ± SD 0,35 ± 0,13 ved sjette uke til 0,62 ± 0,10 ved 10. uke; P <.01) (Figur 2 (c)). Ved slutten av 10. uke, sammenlignet MED DHJST-gruppen, øker indeksen for apoptosecelle bemerkelsesverdig i kontrollgruppen (P < .01) (Figur 2 (d)). Det var ingen signifikante forskjeller i apoptosecelleindeks MELLOM OSA-gruppen OG DHJST-gruppen (P >.05).

3.3. Hemming AV VEGF Og HIF-1Α Ekspresjon i Bruskceller Er Assosiert med DHJST Utøver Terapeutisk Effekt

Fluorescerende kvantitativ PCR indikerte at ekspresjonen AV VEGF mRNA og HIF-1Α mRNA er lav i normalgruppen; mens aktiviteten øker gradvis og signifikant i kontrollgruppen sammenlignet med normal gruppe (P < .01); i kontrollgruppen begynner HIF-1Α i artikulære kondrocytter å øke ved sjette uke etter operasjonen, ytterligere øker ved 10. uke sammenlignet med ved sjette uke (gjennomsnittlig ± SD 94.21 ± 20.12 i sjette uke, og 160.35 ± 72.27 i 10. uke; P <.05) (Tabell 2). Ved 10. helg ble UTTRYKKET FOR VEGF mRNA og HIF-1Α mRNA i DHJST-gruppen signifikant redusert sammenlignet med det i kontrollgruppen etter administrering (P <.01). SELV OM VEGF mRNA-og HIF-1Α mrna-nivået i OSA-gruppen hadde en tendens til å bli redusert MED 4 ukers OSA-behandling sammenlignet med kontrollgruppen, var det ingen signifikant forskjell (Tabell 3).

4. Diskusjon

ACLT-modellen er en AV DE mest brukte eksperimentelle modellene AV OA. Kanin ACLT blir stadig mer brukt I oa-studier fordi sykdomsutbrudd er rask. Bruken av eksperimentelle ACLT-modeller er av særlig klinisk relevans, siden brudd på ACL forekommer hos mennesker og også fører til utvikling av OA. Studie indikerer at store mengder kondrocytter apoptose eksisterer under progressiv stadium AV OA hos kaniner indusert ved kirurgi. Chondrocyte apoptose er en av de karakteristiske endringene AV oa brusk. Patologisk apoptose under betingelse av skadelig stimulering kan resultere i frigjøring av kjemotaksis eller inflammatoriske faktorer, noe som igjen forverrer bruskskade og aktiverer smerte . Derfor kan hemming av kondrocytapoptose være en viktig strategi mot degenerative endringer i kaninenes kneledd. Chondrocytes apoptose indeks I DHJST-gruppen reduseres betydelig sammenlignet med i modellgruppen, noe som tyder på at hemming av chondrocyt apoptose kan være en av DE viktigste MEKANISMENE FOR DHJST mot degenerative endringer.

Tidligere studier har vist den hypoksiske naturen til leddkondrocytens mikromiljø. Interessant, osteoarthritic ledd viste ytterligere redusert oksygennivå, rolle hypoksi under patogenesen AV OA . En nylig studie beskrev at i artikulære kondrocytter er katabolisk og hypoksisk stress sterke induktorer av transkripsjonsfaktoren HIF-1, som er hovedregulatoren for cellulær tilpasning til lave oksygennivåer. HIF-1 er av sentral betydning for overlevelse og vekststans av kondrocytter under bruskutvikling samt energiproduksjon og matrikssyntese av kondrocytter i sunn og osteoartritisk brusk. I osteoartritisk brusk øker proteinnivåene AV HIF-1 betydelig, og aktiviteten korrelerer med alvorlighetsgraden av degenerative bruskendringer . Det foreliggende arbeidet dokumenterer viktigheten av transkripsjonsfaktoren HIF-1Α for å opprettholde integriteten til hypoksisk leddbrusk. Overskuddsnivåene AV HIF-1Α sammenfalt med økt apoptose av leddkondrocytter og førte til degenerative endringer i kaninenes kneledd. ETTER administrering av DHJST reduseres hif-1α, sammenlignet med modellgruppens uttrykk. Resultatene viser AT VIRKNINGEN AV DHJST på regulerende funksjon av kondrocytter, kan ved å hemme aktiviteten TIL HIF-1Α.

det er interessant at det forskjellige uttrykket FOR VEGF og HIF-1Α mellom DHJST-gruppen og OSA-gruppen er signifikant etter administrering. Flere studier har vist at visse ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler, som indometacin, forårsaker antiinflammatoriske effekter uavhengig av HIF-1Α aktivitet, fordi indometacin ikke hemmer fosfatidylinositol 3-kinase eller ekstracellulær signalregulert kinase/mitogenaktivert proteinkinasevei, samt Erk-aktivitet . Indometacin er derimot i stand til å aktivere peroksisomproliferatoraktivert reseptor-γ, som ikke er følsom overfor natriumsalisylat eller aspirin. Hemming av fosfatidylinositol 3-kinase eller Erk er relatert til hemming AV HIF-1Α og angiogene faktorer .

Hypoksi og ulike vekstfaktorer/cytokiner øker VEGF-uttrykket . VEGF er ikke bare en av de viktigste angiogenesefaktorene, MEN er også involvert i inflammatoriske prosesser I OA og bidrar til symptomer som smerte og hevelse ved å målrette synovialmembranene . Siden mekanisk overbelastning er en av årsakene til OA, studerte vi dens effekt PÅ VEGF-uttrykk på kaninbrusk at uttrykket AV VEGF avtar etter administrering AV DHJST, resultatet indikerer AT DHJST kan beskytte leddbrusk ved å undertrykke VEGF-uttrykket i kondrocytter(Figur 3).

5. Konklusjoner

hittil er de bioaktive ingrediensene i DHJST ukjent, men vår studie indikerer AT DHJST utøver signifikant terapeutisk effekt PÅ oa hos kaniner, gjennom mekanismer for å hemme kondrocyteapoptose og regulere ekspresjonen AV VEGF, HIF-1Α i kondrocytter. Dette gir vitenskapelig bevis for klinikken å bruke DHJST i behandling AV OA.

Finansiering

Natural Science Foundation Of Shanghai (stipendnummer: 08JC1418800).