Als u voldoende tijd en een trillingsvrije omgeving had, kon u geduldig wachten en de zwaartekracht zou de meeste zwevende deeltjes naar de bodem van een centrifugebuis brengen. De kleinste deeltjes zouden waarschijnlijk in opschorting wegens Brownse motie blijven, en de meeste macromoleculen zouden uniform worden verdeeld omdat zij in oplossing eerder dan opschorting zouden zijn. Ik weet niet hoe het met jou zit, maar ik heb niet het geduld dat nodig is om alleen op zwaartekracht te vertrouwen voor het scheiden van vaste en vloeibare componenten. Bovendien, voor praktische doeleinden de pellet die u verkregen zou veel te gemakkelijk worden verstoord voor effectieve scheiding van vast materiaal uit supernatant. Zwaartekracht zou geen zeer effectieve manier zijn om zwevende materialen te scheiden op basis van grootte of andere kenmerken.
het beschrijven van centrifugatieomstandigheden
bij het afschrijven van een centrifugatie in materialen en methoden is het zelden nodig meer te rapporteren dan de kracht, de tijd en de temperatuur van de centrifugatie. De vereiste snelheid (rpm) is afhankelijk van de gebruikte centrifuge en rotor, die van lab tot lab verschillen. Het is dus zelden relevant om het merk van de centrifuge,het type rotor of de snelheid te rapporteren.
het centrifugatieproces
centrifugeren produceert een centripetale kracht die vele honderden of duizenden keren de zwaartekracht kan zijn, waardoor het proces aanzienlijk wordt versneld. Hoe groter het aantal omwentelingen per minuut (RPM), hoe groter de zwaartekracht. Het nut van centrifugeren in celfractionering zou beperkt zijn als we alleen zwevende deeltjes naar de bodem van een buis konden drijven. Onderzoekers zijn echter in staat om de grootte van deeltjes die naar beneden worden gebracht te controleren, dankzij de fysica van deeltjes in suspensie.
in een suspensie van ronde deeltjes met gelijke dichtheid maar met verschillende diameters is de kracht die een bepaald deeltje naar de bodem drijft gelijk aan zijn massa maal de toegepaste versnelling. Het volume van het deeltje is een functie van zijn straal, en de massa is gelijk aan het volume maal de dichtheidscoëfficiënt, die een constante is. Het volume van een bol is gelijk aan 4/3 maal pi (een constante) maal de kubus van de straal. Voor een suspensie van bolvormige deeltjes van gelijke dichtheid onder een specifieke reeks voorwaarden, is de enige variabele die de kracht op een bepaald deeltje bepaalt zijn straal.
De weerstand tegen beweging door een oplossing is evenredig met dat deel van het oppervlak dat door het medium duwt. Voor deeltjes van vergelijkbare vorm, ondervinden kleinere deeltjes minder weerstand dan Grotere. Aangezien het oppervlak van een bol 4 maal pi maal het kwadraat van de straal is, en 4 maal pi een constante is, is voor bolvormige deeltjes van gelijke samenstelling de enige variabele die de weerstand onder een gegeven reeks omstandigheden bepaalt de straal van het deeltje.
de stuwkracht neemt evenredig toe met de kubus van de straal. Weerstand tegen beweging neemt proportioneel toe aan het vierkant van de straal. Het is niet moeilijk om te zien dat als de straal van een deeltje toeneemt, zijn neiging om de bodem te benaderen ook toeneemt. Voeg een aanzienlijke hoeveelheid ‘drag’, en de zwaartekracht experiment dat is toegeschreven aan Galileo werkt niet zo goed, immers. Aangezien het sediment van grote deeltjes sneller dan kleine deeltjes, kan een onderzoeker grote van kleine organellen, cellen, enz. scheiden. eenvoudig door het regelen van de tijd en het toerental van een centrifuge run.
fractionering door differentiële centrifugering
voor een typisch celhomogenaat, a 10 min. spin bij lage snelheid (400-500 x g) levert een pellet bestaande uit ongebroken Weefsel, hele cellen, celkernen, en grote puin. De lage snelheid pellet wordt traditioneel de nucleaire pellet genoemd. A 10 min. spin aan een matig snelle snelheid, die krachten van 10.000 tot 20.000 x G brengt naar beneden mitochondria samen met lysosomen en peroxisomen. Daarom wordt de tweede pellet in het traditionele celfractioneringsschema de mitochondriale pellet genoemd.
verdere celfractionering door differentiële centrifugering vereist het gebruik van een ultracentrifuge. Een dergelijk instrument is ontworpen om rotoren te laten draaien bij hoge hoeksnelheden, om zeer hoge G-krachten te genereren. De lucht moet uit de kamer worden gepompt om warmteophoping door luchtwrijving te voorkomen. In feite zijn veel rotoren die zijn ontworpen voor een ultracentrifuge niet eens aerodynamisch gebouwd, omdat ze in een vacuüm worden gesponnen. Een ultracentrifuge van één uur die een kracht genereert van ongeveer 80.000 x g levert een microsomale pellet op. De microsomen omvatten fragmenten van membraan, met inbegrip van celmembraan en endoplasmic reticulum. Membraanfragmenten vormen blaasjes wanneer verstoord in een waterig medium, zodat onderzoek zou onthullen talrijke membraanblaasjes van verschillende grootte. De blaasjes zelf kunnen worden gescheiden op basis van dichtheid, toe te schrijven aan variërend eiwitgehalte. Maar dat is een onderwerp voor een ander document.
draai gedurende enkele uren bij 150.000 x g of zo, en je kunt ribosomen en zelfs de grootste macromoleculen naar beneden halen. De supernatant die blijft bestaat uit oplosbare componenten van het cytoplasma, met inbegrip van zouten, kleine macromoleculen en precursormoleculen, en opgeloste gassen.