RNases zijn als de baddie super-helden onder laboratorium enzymen. Ze zijn almachtig, destructief en schijnbaar onverwoestbaar.
Dit is omdat ze werden gemaakt door kwade opperheren, met als enig doel het leven moeilijk te maken voor de dappere wetenschappers die elke dag strijden om hoogwaardige, intacte RNA preps te produceren.
Ok, Ik maak een grapje over het overlords gedeelte. Maar waarom hebben RNases al die superkrachten? En wat kun je doen om ze te verslaan? Laten we dat uitzoeken.
de superkrachten van RNases, uitgelegd.
RNases zijn almachtig
Dit is waar. RNases worden gevonden in alle celtypes en organismen van prokaryotes aan eukaryotes. dat wil zeggen dat ze overal zijn. Dit is een van de belangrijkste redenen waarom ze zo ‘ n probleem zijn in het lab. Ze zweven in de lucht, op elk oppervlak van je lichaam. Wat betekent dat ze alles besmetten wat de lucht of enig oppervlak van je lichaam heeft aangeraakt. Dat is eigenlijk alles. Ook RNase A in het bijzonder adsorbeert zeer sterk aan glas, waardoor het nog moeilijker om het te verwijderen uit uw flessen etc.
Rnasen zijn zeer destructief
Rnasen hebben over het algemeen een zeer hoge specifieke activiteit ten opzichte van hun substraat (RNA). Dit betekent dat de kleinste hoeveelheid RNase gemakkelijk door uw kostbare RNA preps kan scheuren. Overigens is dit ook één van de redenen dat een RNase (RNase A) het eerste enzym was om zijn mechanisme van katalyse te hebben afgeleid (Findlay et al 1962).
RNases zijn schijnbaar onverwoestbaar
ze vertonen een Phoenix-achtige herstel na autoclaaf
conventionele wijsheid zegt dat als je RNases autoclaaf, ze denatureren, maar dan renatureren en opnieuw partiële functie na afkoeling. Deze verbazingwekkende, legendarische kracht wordt mogelijk gemaakt door een reeks intramoleculaire disulfidebindingen die de structuur intact houden, zelfs nadat de waterstofbindingen die normaal de 3D-eiwitstructuur op zijn plaats houden, zijn verbroken. Zoals alle fabels, is dit tot op zekere hoogte waar. Maar Lees verder en we zullen ontdekken dat deze bijzondere superkracht is opgehoopt door de spin doctors bij RNase Baddies Inc.
zelfs EDTA kan ze niet stoppen!
In tegenstelling tot andere nucleasen hebben veel Rnasen geen metaalionen nodig voor de katalyse omdat zij de 2-prime hydroxylgroep van het RNA-substraat als reactieve species gebruiken, zodat het toevoegen van TE hen niet remt, zoals het zou doen bij DNA-munching nucleases.
hoe de kwaadaardige RNases te verslaan
maak je geen zorgen, collega-wetenschapper. RNases zijn misschien formidabele vijanden, maar ze hebben zwakke punten die we kunnen uitbuiten.
schop ze in de H ‘ S
Rnasen zijn afhankelijk van histidineresiduen in hun actieve plaats voor katalyse. Dus diethylpyrocarbonaat (DEPC), een histidine-specifiek alkylerend middel, kan ze inactiveren. Autoclaaf zal dan verwijderen de DEPC om te stoppen met het alkaliseren van andere eiwitten in U, of uw monsters.
Autoclaving werkt, in zekere mate
De veel Legendarische onverwoestbaarheid van RNases in het gezicht van autoclaving is waar in de kern, maar ook zeer over-hyped, zoals ik hierboven vermeld. Een leuke studie van Ambion toonde aan dat RNases (of RNase A tenminste) niet volledig bestand zijn tegen autoclaafvorming. In plaats daarvan wordt hun activiteit gedecimeerd door autoclaaf, maar een klein deel van de RNase-activiteit blijft na autoclaaf.
maar als kuur een kleine hoeveelheid RNAse heeft nog steeds veel RNA munching power. Dit betekent dat routine autoclaaf als onderdeel van uw RNase decontaminatie procedures is zeker de moeite waard – het is gewoon dat je niet kunt vertrouwen op het om alle activiteit te verwijderen.
ze kunnen niet tegen de (droge) hitte
terwijl natte hitte (autoclaaf) RNAses gedeeltelijk vernietigt, is er geen hoop dat ze bestand zijn tegen droge hitte. De droge hitte oxideert RNAses-om het even welke andere proteã ne, maakt niet uit hoe robuust hun zijn. Dus voor het reinigen van uw glaswerk, een paar uur bij 180 graden moet het doen.
chemische oorlogsvoering
Voor het reinigen van oppervlakken kunnen Rnasen, zo robuust als ze zijn, niet tegen waterstofperoxide, sterke zuren/basen, Trizol enz. Deze worden allemaal vaak gebruikt om zich te ontdoen van zelfs de zwaarste RNases.
Kryptoniet voor RNases: Remmers
misschien is het beste wapen dat we in onze wapenkamer hebben tegen RNAses RNase-remmers. Meestal, commerical RNase inhibitors zijn versies van placental ribonuclease inhibitor (RI). Als iemand die een jaar probeert om RNA in situ hybridisatie te perfectioneren zonder de hulp van een RNase-remmer (als gevolg van een valse economie door mijn baas!), Ik weet hoe goed dit RNase Kryptoniet is. Eén microliter RI en opeens begonnen mijn experimenten te werken.
Ik zeg dat dit het beste wapen is in onze wapenkamer tegen RNases omdat, in tegenstelling tot alle andere oplossingen die hierboven worden genoemd, RNase-remmers specifiek zijn, dus je kunt ze (over het algemeen) precies plaatsen waar het telt in je workflow en de bescherming krijgen die je nodig hebt tegen de slechte. Wees niet zonder dit spul als je met RNA werkt.
heeft dit u geholpen? Dan kunt u delen met uw netwerk.