La biotine et son partenaire de liaison avidine sont couramment utilisés aujourd’hui en biologie moléculaire pour un éventail de techniques et de protocoles différents. Dans cet article, nous discuterons du rôle naturel de la biotine, de la biotine, de la découverte de l’interaction biotine-avidine et des utilisations de la biotine en biologie moléculaire!
En savoir plus sur la biotinylation in vivo des protéines de fusion bactérienne
La biotine est une vitamine essentielle à la vie
Bien que la biotine soit le plus souvent connue pour son rôle en biologie moléculaire, la biotine (vitamine H ou vitamine B7) est d’abord une coenzyme essentielle dont tous les organismes ont besoin pour la vie. La biotine n’est synthétisée que par les plantes, la plupart des bactéries et certains champignons, de sorte que les mammifères doivent obtenir la vitamine par des sources externes. Les humains absorbent la majeure partie de la biotine dont ils ont besoin dans l’intestin grêle à partir de la microflore qui y réside.
La biotine est un cofacteur qui, sous sa forme active, est fixé de manière covalente au site actif d’enzymes métaboliques clés, notamment la biotine carboxylase et les décarboxylases. Ces enzymes catalysent le transfert de groupes carboxyles en acides organiques pour produire d’importants métabolites cellulaires. La biotine agit comme un transporteur carboxylique d’un composé à l’autre. Ces enzymes dépendantes de la biotine sont essentielles pour des processus tels que la gluconéogenèse, la lipogenèse, le métabolisme des acides aminés et la transduction d’énergie.
La biotinylation est le processus général par lequel la biotine est ajoutée à une protéine ou à une macromolécule. La biotine peut être ajoutée par voie enzymatique ou chimique. La biotinylation enzymatique se produit naturellement dans les cellules et est le processus par lequel la biotine est liée de manière covalente à une lysine spécifique au site actif d’une enzyme nouvellement synthétisée. La protéine ligase de biotine (BPL) est responsable de cette modification protéique post-traductionnelle hautement spécifique. La plupart des organismes ont moins de cinq enzymes dans le protéome entier qui sont biotinylées. Chez E.coli par exemple, le BPL, BirA, est responsable de la biotinylation d’une seule lysine dans l’organisme entier sur la protéine porteuse de biotine carboxyle (BCCP).
Découverte de l’interaction biotine-avidine
À la fin des années 1930, il a été observé que les animaux nourris principalement de blancs d’œufs développaient des lésions cutanées et d’autres problèmes de santé terribles. Cette maladie a été appelée « lésion du blanc d’œuf » et a été déterminée comme étant due à une carence en vitamine H renommée plus tard Vitamine B7 / biotine. Une lésion du blanc d’œuf ravagerait ces animaux même si leur alimentation était complétée par de la biotine. Ainsi, quelque chose dans le blanc d’œuf empêchait la biotine d’être absorbée. En 1940, Esmond E. Snell a pu purifier la protéine responsable de la liaison de la biotine, l’avidine. Avidin a été nommé à juste titre pour le poulet, « aviaire », œuf dont il a été purifié. Snell a confirmé plus tard que l’avidine était bien le coupable de la lésion du blanc d’œuf en nourrissant des rats avec de l’avidine purifiée (Kresege et al., 2004). L’avidine est une glycoprotéine constituée de quatre sous-unités identiques pouvant chacune se lier à une molécule de biotine.
La biotine et l’avidine ont une affinité extrêmement forte l’une pour l’autre. En fait, la liaison entre eux est l’une des interactions protéine-ligand non covalentes les plus fortes trouvées dans la nature. Une fois la liaison formée, elle n’est pas affectée par les changements de pH, de température ou de solvants organiques.
Utilisations de la biotine en biologie moléculaire
La biotine est une molécule soluble dans l’eau relativement petite qui n’interfère pas avec les macromolécules auxquelles elle est ajoutée. La biotine possède également une chaîne latérale exposée qui peut être facilement manipulée pour fabriquer des espèces réactives sans affecter le site de liaison de l’avidine. Avec toutes ces caractéristiques, il n’est pas surprenant que les scientifiques aient commencé à exploiter la biotine et sa forte interaction avec l’avidine à des fins de biologie moléculaire et de biotechnologie.
Une fois qu’un polypeptide est biotinylé (plus d’informations ci-dessous), il peut être incubé ou co-exprimé avec l’avidine ou une protéine structurellement similaire découverte dans les années 1960, la strepavidine. Le complexe Biotine-avidine peut ensuite être utilisé et/ou manipulé aux fins prévues par le scientifique. Deux des utilisations les plus courantes de la biotinylation en laboratoire sont la purification des protéines et les expériences d’immunoprécipitation. Les protéines ou complexes biotinylés peuvent être facilement purifiés à l’aide de colonnes ou de billes enrobées d’avidine.
L’interaction biotine-avidine a également été adaptée pour une utilisation en immunohistochimie et en marquage des anticorps. Dans ces expériences, la biotine est ajoutée à un anticorps primaire ou secondaire qui cible respectivement votre protéine d’intérêt ou votre anticorps primaire. L’avidine liée à un rapporteur est ensuite ajoutée à la réaction pour une détection facile. Les multiples sites de liaison à la biotine trouvés sur l’avidine sont également idéaux pour l’amplification du signal lors de ces expériences. Pendant la détection, une enzyme rapporteuse biotinylée pré-incubée avec de l’avidine libre peut être ajoutée à votre échantillon. Tous les sites libres de liaison à la biotine sur ce complexe peuvent se lier à votre anticorps biotinylé. Cela crée un grand maillage de complexes biotine-avidine liés à votre protéine d’intérêt, ce qui permet d’amplifier le signal rapporteur et de faciliter la détection. Cette stratégie est appelée immunohistochimie du complexe Avidine-biotine (ABC) (IHC). Pour plus d’informations sur ABC et IHC, consultez le guide de Thermo Fisher Scientific.
Il existe un éventail d’autres applications de biologie moléculaire pour la biotine et l’avidine. Une courte liste d’autres applications courantes et des liens vers des articles et des pages Web pertinents sont énumérés ci-dessous.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotine et avidine, les macromolécules d’intérêt doivent d’abord être biotinylées. Les scientifiques ont mis au point plusieurs méthodes pour biotinyler chimiquement des macromolécules d’intérêt à la fois in vitro et in vivo.
Réactifs de biotinylation:
La chaîne latérale exposée de la biotine peut être réticulée à des groupes fonctionnels d’acides aminés in vivo via des produits chimiques spécialisés (réactifs de biotinylation). Il existe une variété de réactifs de biotinylation disponibles qui diffèrent par les groupes fonctionnels ou les résidus qu’ils ciblent, ainsi que par leur solubilité, et différents réactifs sont donc utiles pour la biotinylation dans différents microenvironnements. Il existe également des réactifs de biotinylation réversibles et clivables pour aider à l’élution spécifique des protéines biotinylées. Pour vous aider à déterminer quel réactif de biotine utiliser, consultez l’outil de sélection des réactifs de biotine de Thermo Fisher Scientific.
AviTag et BirA :
Les protéines peuvent également être biotinylées en exploitant la spécificité de l’E.coli BPL, BirA. Si vous vous en souvenez, BirA ne biotinyle qu’une seule lysine dans l’ensemble du protéome d’E.coli. En utilisant ces connaissances, les scientifiques ont identifié la séquence de 13 acides aminés requise pour la reconnaissance et la biotinylation du BirA. Cette séquence de 13 acides aminés est appelée AviTag. En utilisant AviTag, on peut marquer une protéine d’intérêt avec de la biotine en créant simplement une fusion dans laquelle AviTag est ajouté à l’extrémité N ou C de la protéine. Il a été démontré que BirA biotine efficacement les protéines exprimant l’AviTag dans les cellules de bactéries, de levures, d’insectes et de mammifères. Découvrez Kay et al., 2009 pour les méthodes de biotinylation des protéines avec BirA.
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Marquage des oligonucléotides :
La biotine peut être ajoutée à l’une ou l’autre extrémité d’une séquence d’ADN au cours d’une Réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l’aide d’une amorce biotinylée. La biotine peut également être incorporée par voie enzymatique pendant la PCR à l’aide d’un dUTP marqué à la biotine. Il existe plusieurs types d’étiquettes de biotine qui peuvent être ajoutées à un oligonucléotide en fonction de votre application en aval. Les oligonucléotides marqués à la biotine peuvent être utilisés dans une multitude d’applications, y compris, mais sans s’y limiter, l’hybridation in situ, le buvardage (Nord et Sud) et la liaison par affinité.
Photobiotinylation:
La photobiotine peut être utilisée pour marquer de manière non sélective l’ADN et l’ARN. L’acétate de photobiotine consiste en une molécule de biotine attachée à un groupe arylazide photoréactif. Sous une forte lumière visible, le groupe arylazide devient réactif et forme un lien avec les acides nucléiques voisins (McInnes et al., 1990). La photobiotinylation est parfois plus facile et moins coûteuse que d’autres méthodes enzymatiques. Les scientifiques ont couramment utilisé cette méthode pour attacher des protéines ou des polypeptides à un substrat solide (Holden et Cremer, 2003).
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Ressources supplémentaires sur le blog Addgene
- biotinylation in vivo des protéines de fusion bactérienne
- Apprenez comment la biotine est utilisée dans le Split-BioID: Une méthode améliorée pour étudier les interactions protéine-protéine
- Apprenez comment la biotine peut être utilisée avec CRISPR