a hemólise induzida por HlyA requer a activação dos receptores purinérgicos.sobrenadante da estirpe E. coli ARD6 de E. coli produtora de α-hemolisina (HlyA) lises equine, human, and murine erythrocytes (Fig. 1). A figura 1 mostra a hemólise induzida por HlyA como uma função do tempo. Experimentos com lapso de tempo com eritrócitos humanos e murinos ligados a Tampas revelaram que a hemólise induzida por HlyA é um processo sequencial. Nos primeiros 20 minutos, HlyA induziu a crenação dos glóbulos vermelhos como resultado do encolhimento celular, seguido por um aumento gradual do volume e, finalmente, lise das células (figos. 1A E 1B, Movie S1). Este encolhimento sequencial e inchaço também se aplica ao nível das células únicas. Assim, não são populações diferentes de glóbulos vermelhos que encolhem ou incham, mas sim que um único eritrocito encolhe primeiro e depois incha como consequência da aplicação de HlyA. A suspensão eritrocitária (1,25%) foi incubada com sobrenadante diluído de E. coli (50 µl · ml−1). Os eritrócitos das três espécies testadas mostraram uma diferença significativa na capacidade de resposta ao HlyA (Fig. 1C) com a menor sensibilidade a HlyA nos eritrócitos humanos. Em todas as experiências seguintes, a quantidade de sobrenadante de E. coli adicionada foi ajustada para produzir ≈50% de hemólise após uma incubação de 60 minutos.
iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1. hemólise induzida pela α-hemolisina nos eritrócitos equinos, murinos e humanos. A) Efeito Da α-hemolisina contendo E. coli (ARD6, serótipo OK: K13:H1) sobrenadante em eritrócitos humanos ligado a uma tampa após incubação de 10, 20 e 60 minutos a 37 °C (Ver também o filme S1). B) dados resumidos. A quantidade total de eritrócitos drenados (colunas abertas) e eritrócitos lisados (colunas pontilhadas) ao longo do tempo analisados em sequências de imagens recolhidas ao longo de 60 minutos, a 0,1 Hz (n = 8 humanos). C) a hemólise Global é demonstrada como um aumento da densidade óptica a 540 nm (OD540), reflectindo a concentração de hemoglobina na solução. Os eritrócitos foram incubados com sobrenadante de E. coli (50 µl·ml−1) de 0 a 60 minutos. n = 5, 7 e 6 para os equídeos, murinos e humanos, respectivamente.geralmente usamos o sobrenadante filtrado de E. coli (ARD6) para induzir hemólise, salvo indicação em contrário. Esta abordagem foi escolhida para garantir que os nossos resultados também se aplicariam in vivo onde HlyA é libertado de E. coli juntamente com vários outros componentes. Ao escolher esta abordagem, nós tivemos, no entanto, que verificar que a hemólise induzida pela E. coli produtora de HlyA poderia de fato ser atribuída a HlyA. Portanto, purificamos HlyA da nossa cultura ARD6. Após a purificação, uma suspensão do HlyA purificado foi separada num gel de 5-15% de sulfato de sódio e dodecilo (SDS). Uma única banda de 100 kDa apareceu após Coomassie R coloração, e a espectroscopia de massa identificou a banda como HlyA (Fig. S1 A E B). Como controlo adicional, usamos o sobrenadante da estirpe de E. coli D2103, uma estirpe laboratorial não-patológica de E. coli que não produz HlyA. O sobrenadante destas bactérias não induziu hemólise em eritrócitos humanos, murinos ou equinos(Fig. S1D). Além disso, comparamos nossas descobertas com a hlya gentilmente fornecida pelo Prof. Sucharit Bhakdi, Universidade de Mainz, Alemanha (com a atividade de 10 ng * ml-1 para ≈50% hemólise, Fig. S2). No seguinte, quando o hlya purificado é mencionado, é com referência a esta preparação. Durante os testes iniciais da actividade biológica da HlyA, descobrimos que a apirase ATP-scavenger inibiu completamente a hemólise induzida pela HlyA dos eritrócitos equinos. Este achado foi verdadeiramente surpreendente, pois implicava ATP extracelular necessária para a hemólise infligida por E. coli produtora de HlyA. Como ATP extracelular é uma molécula sinalizadora que ativa os receptores P2, nossos achados podem sugerir que o modelo de poros prevalecente para hemólise induzida por HlyA pode ser uma simplificação. Portanto, testamos o efeito da ATP vasculhando mais profundamente. Descobrimos que a apirase inibiu completamente a hemólise não só dos equídeos, mas também dos eritrócitos humanos e murinos (Fig. 2A). Além disso, a hexocinase, que rapidamente degrada o trifosfato de adenosina (ATP) ao difosfato de adenosina (ADP), reduziu similarmente a hemólise induzida por HlyA nas células vermelhas do sangue de origem murina e humana de uma forma dependente da concentração (Fig. 2B). Esta conclusão foi verificada por hlya purificada (Fig. 2B, inset). Vale a pena notar que, nos eritrócitos humanos, tanto a apirase como a hexocinase potenciaram a hemólise induzida por HlyA em concentrações mais baixas. A distinção pode sugerir uma diferença no padrão de expressão do receptor P2 nos glóbulos vermelhos entre as espécies.Fig. 2. a hemólise induzida por HlyA dos eritrócitos é inibida pelas ectoATPases e pelos antagonistas purinérgicos. Sobrenadante de E. coli (60 minutos) induz hemólise dos eritrócitos humanos (quadrados), murinos (círculos cheios) e equinos (círculos abertos). A) curvas de concentração-resposta para a apirase do necrófago ATP. O Inset apresenta uma imagem representativa do sobrenadante dos eritrócitos murinos submetido a HlyA na presença de apirase 0, 1, 2, 5 ou 10 U ml−1. B) efeito da hexoquinase na lise induzida por HlyA dos eritrócitos humanos, murinos e equinos; o inset mostra o efeito da hexoquinase (10 U ml−1) na hemólise induzida pela HlyA purificada nos eritrócitos murinos e humanos). C) efeito do antagonista dos receptores P2 não selectivo PPADS na lise induzida por HlyA dos eritrócitos das três espécies. D) Relação concentração–resposta dos PPADS a várias concentrações de HlyA purificada nos eritrócitos humanos. A hemólise foi medida como OD540. Os valores são médios ± SEM; n = 5-13.
a hemólise induzida por HlyA requer a activação dos receptores purinérgicos.sobrenadante da estirpe E. coli ARD6 de E. coli produtora de α-hemolisina (HlyA) lises equine, human, and murine erythrocytes (Fig. 1). A figura 1 mostra a hemólise induzida por HlyA como uma função do tempo. Experimentos com lapso de tempo com eritrócitos humanos e murinos ligados a Tampas revelaram que a hemólise induzida por HlyA é um processo sequencial. Nos primeiros 20 minutos, HlyA induziu a crenação dos glóbulos vermelhos como resultado do encolhimento celular, seguido por um aumento gradual do volume e, finalmente, lise das células (figos. 1A E 1B, Movie S1). Este encolhimento sequencial e inchaço também se aplica ao nível das células únicas. Assim, não são populações diferentes de glóbulos vermelhos que encolhem ou incham, mas sim que um único eritrocito encolhe primeiro e depois incha como consequência da aplicação de HlyA. A suspensão eritrocitária (1,25%) foi incubada com sobrenadante diluído de E. coli (50 µl · ml−1). Os eritrócitos das três espécies testadas mostraram uma diferença significativa na capacidade de resposta ao HlyA (Fig. 1C) com a menor sensibilidade a HlyA nos eritrócitos humanos. Em todas as experiências seguintes, a quantidade de sobrenadante de E. coli adicionada foi ajustada para produzir ≈50% de hemólise após uma incubação de 60 minutos.
iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1. hemólise induzida pela α-hemolisina nos eritrócitos equinos, murinos e humanos. A) Efeito Da α-hemolisina contendo E. coli (ARD6, serótipo OK: K13:H1) sobrenadante em eritrócitos humanos ligado a uma tampa após incubação de 10, 20 e 60 minutos a 37 °C (Ver também o filme S1). B) dados resumidos. A quantidade total de eritrócitos drenados (colunas abertas) e eritrócitos lisados (colunas pontilhadas) ao longo do tempo analisados em sequências de imagens recolhidas ao longo de 60 minutos, a 0,1 Hz (n = 8 humanos). C) a hemólise Global é demonstrada como um aumento da densidade óptica a 540 nm (OD540), reflectindo a concentração de hemoglobina na solução. Os eritrócitos foram incubados com sobrenadante de E. coli (50 µl·ml−1) de 0 a 60 minutos. n = 5, 7 e 6 para os equídeos, murinos e humanos, respectivamente.geralmente usamos o sobrenadante filtrado de E. coli (ARD6) para induzir hemólise, salvo indicação em contrário. Esta abordagem foi escolhida para garantir que os nossos resultados também se aplicariam in vivo onde HlyA é libertado de E. coli juntamente com vários outros componentes. Ao escolher esta abordagem, nós tivemos, no entanto, que verificar que a hemólise induzida pela E. coli produtora de HlyA poderia de fato ser atribuída a HlyA. Portanto, purificamos HlyA da nossa cultura ARD6. Após a purificação, uma suspensão do HlyA purificado foi separada num gel de 5-15% de sulfato de sódio e dodecilo (SDS). Uma única banda de 100 kDa apareceu após Coomassie R coloração, e a espectroscopia de massa identificou a banda como HlyA (Fig. S1 A E B). Como controlo adicional, usamos o sobrenadante da estirpe de E. coli D2103, uma estirpe laboratorial não-patológica de E. coli que não produz HlyA. O sobrenadante destas bactérias não induziu hemólise em eritrócitos humanos, murinos ou equinos(Fig. S1D). Além disso, comparamos nossas descobertas com a hlya gentilmente fornecida pelo Prof. Sucharit Bhakdi, Universidade de Mainz, Alemanha (com a atividade de 10 ng * ml-1 para ≈50% hemólise, Fig. S2). No seguinte, quando o hlya purificado é mencionado, é com referência a esta preparação. Durante os testes iniciais da actividade biológica da HlyA, descobrimos que a apirase ATP-scavenger inibiu completamente a hemólise induzida pela HlyA dos eritrócitos equinos. Este achado foi verdadeiramente surpreendente, pois implicava ATP extracelular necessária para a hemólise infligida por E. coli produtora de HlyA. Como ATP extracelular é uma molécula sinalizadora que ativa os receptores P2, nossos achados podem sugerir que o modelo de poros prevalecente para hemólise induzida por HlyA pode ser uma simplificação. Portanto, testamos o efeito da ATP vasculhando mais profundamente. Descobrimos que a apirase inibiu completamente a hemólise não só dos equídeos, mas também dos eritrócitos humanos e murinos (Fig. 2A). Além disso, a hexocinase, que rapidamente degrada o trifosfato de adenosina (ATP) ao difosfato de adenosina (ADP), reduziu similarmente a hemólise induzida por HlyA nas células vermelhas do sangue de origem murina e humana de uma forma dependente da concentração (Fig. 2B). Esta conclusão foi verificada por hlya purificada (Fig. 2B, inset). Vale a pena notar que, nos eritrócitos humanos, tanto a apirase como a hexocinase potenciaram a hemólise induzida por HlyA em concentrações mais baixas. A distinção pode sugerir uma diferença no padrão de expressão do receptor P2 nos glóbulos vermelhos entre as espécies.Fig. 2. a hemólise induzida por HlyA dos eritrócitos é inibida pelas ectoATPases e pelos antagonistas purinérgicos. Sobrenadante de E. coli (60 minutos) induz hemólise dos eritrócitos humanos (quadrados), murinos (círculos cheios) e equinos (círculos abertos). A) curvas de concentração-resposta para a apirase do necrófago ATP. O Inset apresenta uma imagem representativa do sobrenadante dos eritrócitos murinos submetido a HlyA na presença de apirase 0, 1, 2, 5 ou 10 U ml−1. B) efeito da hexoquinase na lise induzida por HlyA dos eritrócitos humanos, murinos e equinos; o inset mostra o efeito da hexoquinase (10 U ml−1) na hemólise induzida pela HlyA purificada nos eritrócitos murinos e humanos). C) efeito do antagonista dos receptores P2 não selectivo PPADS na lise induzida por HlyA dos eritrócitos das três espécies. D) Relação concentração–resposta dos PPADS a várias concentrações de HlyA purificada nos eritrócitos humanos. A hemólise foi medida como OD540. Os valores são médios ± SEM; n = 5-13.
para validar a relevância deste achado, foi importante saber se os antagonistas dos receptores P2 influenciaram a hemólise induzida por HlyA. O antagonista não selectivo dos receptores P2 PPADS diminuiu a concentração de hemólise induzida pela E. coli produtora de HlyA nos eritrócitos equinos, murinos e humanos (Fig. 2C). O valor de EC50 para PPADS foi de 520 µM, 400 µM e 180 µM para os eritrócitos humanos, murinos e equinos, respectivamente. Esta conclusão foi fundamentada para toda a gama de concentrações de HlyA(Fig. 2D) testadas em eritrócitos humanos expostos a HlyA purificada. A relação concentração-resposta foi compatível com antagonismo competitivo, e deve-se notar que o efeito mesmo das concentrações máximas de toxina foi reduzido pelo bloqueador dos receptores P2. Assim, a ativação do receptor P2 parece estar envolvida na hemólise induzida por HlyA. O antagonista não selectivo dos receptores P2, suramina, também diminuiu a hemólise induzida por HlyA em todas as três espécies (dados não apresentados). Em concentrações mais elevadas, suramin, no entanto, causar dramática velocidade de contração, e, portanto, pode não ser adequado para avaliar P2 receptor implicação nos eritrócitos.para avaliar se o efeito do antagonista purinérgico na hemólise foi apenas resultado do aumento da osmolalidade, testámos o efeito da sacarose extracelular na hemólise induzida por HlyA (dados não apresentados). Sacarose (1 mM) apenas diminuiu ligeiramente a hemólise( 5, 1% ± 1, 7%), enquanto que 10 mM e 75 mM a sacarose diminuiu acentuadamente a hemólise (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Dado que as concentrações dos antagonistas e ATPases utilizadas neste estudo nunca excederam 1 mM, o efeito não pode ser resultado de um aumento da osmolaridade. Nem os nossos resultados reflectiam ligação não selectiva entre os antagonistas e a toxina. Esta foi testada em eritrócitos equinos, que foram pré-desnaturados com HlyA durante 10-15 minutos a 37 °C ou durante 30 minutos a 4 °C, cuidadosamente lavados e re-suspensos com ou sem os antagonistas. Como HlyA é incorporada na membrana durante a pré -incubação, os eritrócitos procederam à lise na ausência de HlyA livre. Figo. O S2 mostra que várias intervenções farmacológicas reduziram a hemólise após a hlya ter sido pré-ligada aos eritrócitos. Os antagonistas foram, no entanto, menos eficientes quando adicionados aos eritrócitos lavados em que o processo lítico já foi iniciado.que Receptor(s) de P2 está envolvido na hemólise induzida por HlyA?os eritrócitos expressam vários tipos de receptores P2. O P2 receptores que tem sido relatado para ser expresso em humano maduro eritrócitos incluem P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15), e P2X7 (16), considerando que P2Y1, P2X1, P2X4, e P2X7 parecem estar presentes em erythroid células progenitoras (17). Para testar qual destes receptores purinérgicos participa da hemólise induzida por HlyA, abordamos os receptores em questão individualmente. Como o receptor P2Y1 está implicado na hemólise induzida pelo sorbitol dos eritrócitos humanos e murinos infectados com plasmodium (14), testámos se este receptor era responsável pela hemólise induzida pelo HlyA. O Antagonista dos receptores P2Y1 MRS2179 não afectou a hemólise induzida por HlyA(Fig. S3A) em concentrações (até 500 µM) superiores ao necessário para inibir a hemólise nos eritrócitos infectados pelo Plasmodium berghei (14). Como não existem antagonistas específicos para receptores P2Y2, examinamos o efeito de HlyA em ratinhos transgênicos. A hemólise induzida por HlyA foi semelhante nos eritrócitos de p2y2−/ – e p2y2+/+ ratinhos(Fig. S3B). No caso do P2Y13 nós testamos o antagonista MRS2211, que tem sido relatado para mostrar alguma seletividade em relação ao receptor P2Y13 (18). O MRS2211 diminuiu significativamente a hemólise induzida por HlyA nos eritrócitos humanos e murinos(Fig. S3C). Este achado contradiz os nossos resultados com a hexoquinase (ATP degradante à ADP), que deve estimular em vez de inibir o receptor p2y13 sensível à ADP. Por conseguinte, a hexocinase e a MRS2211 devem apresentar resultados opostos se o receptor P2Y13 estiver envolvido. Como este não é o caso, o receptor P2Y13 é um candidato improvável para o receptor P2 envolvido na hemólise induzida por HlyA. Não podemos excluir a possibilidade de que a inibição produzida pelo MRS2211 seja mediada através de outro receptor P2.em princípio, isto deixa apenas os receptores P2X a serem considerados. Figo. 3A mostra que o bloqueador não seletivo dos receptores P2X Evans blue reduziu potentemente a hemólise induzida por HlyA, sugerindo que um receptor P2X está envolvido nesta hemólise. Dos receptores P2X expressos em eritrócitos, considerámos o P2X7 como o mediador mais provável da hemólise induzida por HlyA pelas seguintes razões. Sabe-se que os receptores P2X7 passam por uma transição para um estado de maior permeabilidade, que eventualmente leva à lise em certas células (12). O receptor P2X7 tem sido relatado para interagir com a proteína do canal pannexin1 (12), e o complexo cria um poro considerável permeável a moléculas maiores como brometo de etídio (13). O Pannexin1 é expresso em glóbulos vermelhos Humanos (19) e foi recentemente sugerido como canal de libertação de ATP nos eritrócitos (20). Para testar se os receptores P2X7 participam da hemólise induzida por HlyA, nós usamos antagonistas com seletividade relativa para P2X7: azul brilhante G( BBG), ATP-2′, 3′-dialdeído (OxATP), e KN-62 (21). A concentração de todos os antagonistas diminuiu dependendo da hemólise nos eritrócitos equinos, murinos e humanos(Fig. 3). Os eritrócitos equino e humano eram mais sensíveis a todas as substâncias testadas em comparação com os eritrócitos murinos. Neste contexto, deve-se mencionar que o receptor Murino P2X7 é conhecido por ser menos sensível ao KN-62 em comparação com o receptor humano (22). A protecção contra a hemólise pelo antagonismo dos receptores P2X foi novamente fundamentada para toda a gama de concentrações de HlyA purificada nos eritrócitos humanos utilizando BBG como exemplo de um antagonista P2X7 (Fig. 3D). Novamente o antagonista mostra um efeito substancial na hemólise induzida por HlyA mesmo sob concentrações de HlyA que produziram hemólise máxima. A inibição da hemólise pelo OxATP foi verificada utilizando HlyA purificada nos eritrócitos murinos e humanos (Fig. 3E, inset). O novo antagonista selectivo e competitivo dos receptores P2X7 A438079 reduziu a hemólise nos eritrócitos humanos, mas foi menos eficiente nos eritrócitos murinos (Fig. 3F). Os imunoblots das fracções de membrana plasmática para o receptor P2X7 confirmam que os eritrócitos humanos e murinos expressam uma proteína de dimensão relevante (66 kDa, Fig. 3G, e em pleno Figo. S4B). Necessitará de investigação adicional para estabelecer completamente a contribuição relativa dos receptores P2X na hemólise induzida por HlyA. Com nossas ferramentas atuais, não podemos excluir a possibilidade de contribuições de outros receptores P2X na hemólise induzida por HlyA em qualquer das espécies estudadas.Fig. 3. a hemólise induzida por HlyA é inibida pelos antagonistas dos receptores P2X7. Hemólise induzida por HlyA em humanos (quadrados), ratos (círculos cheios) e cavalos (círculos abertos). Hemólise induzida pela E. produtora de HlyA. a coli foi reduzida pelo aumento das concentrações de (A) Azul Evans, (B) kn-62 e (C) azul brilhante G (BBG). D) efeito dependente da concentração do BBG em várias concentrações de HlyA purificada. ATP-2′, 3′ – dialdeído (OxATP) (e) reduziu igualmente a hemólise induzida pela E. coli produtora de HlyA e pela toxina purificada (inset, OxATP, 500 µM). F) O Antagonista selectivo P2X7 a438079 demonstrou um efeito principalmente nos eritrócitos humanos. Os valores são médios ± SEM, n = 5-13. G) Imunoblots com um anticorpo C-terminal dirigido contra o receptor P2X7 (diluição 1:200). O painel esquerdo mostra uma mancha semelhante com pré-absorção peptídica.
Fig. S4A mostra a hemólise induzida por HlyA nos eritrócitos murinos (P2X7+/+ e P2X7−/−). Os eritrócitos murinos apresentam um grau semelhante de hemólise em resposta ao HlyA, independentemente do seu genótipo. O p2x7 – / – ratinhos e o p2x7+/+ ratinhos foram originalmente gerados pela Pfizer e foram transformados em fundo BALB / C. Não detectámos quaisquer discrepâncias entre a sensibilidade à hemólise induzida por HlyA nos eritrócitos isolados a partir de ratos BALB/c e C57BL/6 (dados não apresentados), apesar de se saber que a estirpe C57BL/6 tem uma variação genética no Terminal C do receptor P2X7 (23). Estes dados são consistentes com o efeito minúsculo de A438079 nos eritrócitos murinos e a baixa expressão proteica do receptor P2X7 nos eritrócitos murinos (figos. 3F e 3G).estes resultados implicam que há pelo menos um receptor P2 adicional envolvido na hemólise induzida por HlyA nos eritrócitos murinos. Como os P2X1 e P2X7 partilham perfis de inibidores semelhantes para BBG, KN-62 e OxATP (24), testámos os antagonistas P2X1 MRS2159 e NF449. Concentração de MRS2159-hemólise inibida em eritrócitos do cavalo (EC50:150 µM) e do rato (EC50: ≈250 µM). Os eritrócitos humanos foram relativamente insensíveis ao antagonista, mas a uma concentração acima de 250 µM, nós vimos uma pequena e estatisticamente significativa redução (Fig. 4A). Este efeito foi muito mais pronunciado se foi utilizado HlyA purificado(Fig. 4C). Isto implica que pode haver diferenças na resposta celular no que diz respeito ao facto de serem submetidos a HlyA em forma pura ou em combinação com outros constituintes da E. coli. A concentração da NF449 inibe de forma dependente a hemólise induzida pela HlyA no ser humano (Fig. 4B). A NF449 foi muito menos eficiente nos eritrócitos murinos, de acordo com o receptor Murino P2X1 ser relativo resistente a este inibidor (25). Deve-se enfatizar que mesmo que o NF449 seja um derivado suramínico, ele não provocou as mesmas mudanças de volume nos eritrócitos que a suramina. Os imunoblots do receptor P2X1 são conhecidos por mostrar até 4 faixas em vários tecidos; uma 45 kDa não glicosilada, uma 60 kDa glicosilada e uma banda 95/120 kDa que pode ser a forma polimerizada do receptor (26, 27). Nas nossas mãos, o anticorpo receptor P2X1 reconheceu consistentemente uma banda de 45 KD e uma banda de 60 kDa muito fraca em manchas de membranas plasmáticas de eritrócitos humanos e murinos(Fig. 4D). Curiosamente, descobrimos que a expressão de nível 60 kDa banda era muito maior no p2x7 – / – mice em comparação com os controles (semelhante em três preparações, Fig. 4D). Neste imunoblot, os níveis de proteínas são ajustados para evitar sobrecarga das bandas dos ratinhos P2X7−/−, o que deixa a banda de 60 kDa quase indetectável no ratinho P2X7+/+. Esta aparente regulação do receptor P2X1 pode potencialmente esconder um fenótipo hemolítico nos ratinhos com deficiência em receptores P2X7. Em conjunto, estes dados suportam a hipótese de que tanto o receptor P2X1 quanto o receptor P2X7 são relevantes para a hemólise induzida por HlyA. Nossos resultados apontam para significativas variações interespécies, nas quais o receptor P2X7 é mais importante para a hemólise nos eritrócitos humanos.Fig. 4.
efeito dos antagonistas P2X1 (MRS2159 e NF449) na hemólise induzida por HlyA nos eritrócitos equinos, murinos e humanos. A) os eritrócitos foram incubados com sobrenadante E. coli contendo HlyA e com concentrações crescentes de MRS2159 (média ± SEM, n = 7-8). B) os eritrócitos foram incubados com HlyA purificada e com concentrações crescentes de NF449 (média ± SEM, n = 5-6). C) efeito de 250 µM de MRS2159 na hemólise induzida por HlyA purificada. D) Imunoblotting com um anticorpo dirigido contra o receptor P2X1 (diluído 1: 200); o painel direito mostra uma mancha paralela com pré-adsorção peptídica. O isolamento proteico e a imunoblotting foram repetidos três vezes, com resultados semelhantes.a hemólise induzida por HlyA é prevenida pelos antagonistas Pannexin1.carbenoxolona (28), mefloquina e probenecide (30) foram utilizados como antagonistas com selectividade relativa para a pannexin1. A carbenoxolona diminuiu significativamente o nível de hemólise nas três espécies com sensibilidade semelhante(Fig. 5A). O efeito da carbenoxolona foi novamente testado para toda a gama de concentrações de HlyA (toxina purificada, Fig. 5 B), Mostrando também efeitos consideráveis sob concentrações máximas de HlyA. A mefloquina e o probenecide foram testados apenas em eritrócitos murinos e humanos. A CE50 para mefloquina foi de 25 µM em humanos e 18 µM em eritrócitos murinos. A probenecide inibiu a hemólise nos eritrócitos humanos, com uma EC50 de 2 mM, mas foi menos eficaz nos eritrócitos murinos. Recentemente, os antagonistas Cl–channel NPPB e ácido niflumico conhecidos também inibem os canais pannexin (31). Ambas as substâncias reduziram a hemólise induzida por HlyA, com um efeito substancialmente mais pronunciado nos eritrócitos humanos(Fig. S5).Fig. 5. hemólise induzida por HlyA dos eritrócitos humanos, murinos e equinos é inibida pelos antagonistas pannexin1. A hemólise foi induzida pelo sobrenadante contendo HlyA de E. coli. A hemólise foi diminuída em função da concentração pela carbenoxolona (a), que também reduziu a hemólise induzida por hlya purificada em uma ampla gama de concentrações (B). Hemólise induzida pela E. produtora de HlyA. a coli também foi reduzida por mefloquina (C) e probenecide (D). Os valores são indicados como média ± SEM; n = 5-13.