- Mioblastos adotar uma forma alongada para diferenciar e regular o seu actina de rede para a difusão da área
- a organização espacial da rede actin e do núcleo é dirigida pela morfologia do mioblast
- o alongamento celular aumenta a contractilidade do mioblast
- a contractilidade dos pares de células aumentou após a sua fusão e aumentou em micropatterns alongados
- Actomyosin contratilidade promove myotube diferenciação
- Myoblast alongamento dispara YAP nuclear de exportação, o que é essencial para a diferenciação de mioblastos em myotubes
Mioblastos adotar uma forma alongada para diferenciar e regular o seu actina de rede para a difusão da área
Para avaliar a relação entre a célula forma, actina de rede focal e aderências, nós culta mioblastos C2C12 em uma camada homogênea de fibronectina (FN). Após 24 horas de cultura, os mioblastos foram fixados e manchados pela actina para determinar os seus parâmetros morfológicos (Fig. 1A). Os substratos revestidos com FN permitiram o estabelecimento de interacções específicas com substratos celulares através do recrutamento de integrinas transmembranares específicas. Na verdade, várias subunidades Da α integrina que se combinam com a subunidade β1 são expressas durante a miogénese esquelética, sendo importantes na migração celular miogénica, fusão de mioblastos,maturação da fibra muscular ou na manutenção da integrity32, 33. Experiências adicionais realizadas em substratos revestidos de laminina (LAM) indicaram que ambos os parâmetros morfológicos (índice da forma celular, perímetro celular e área celular, Figo suplementar. 1-A) e interacções com substratos celulares (número e área de aderências focais, Figo suplementar. 1B) foram estatisticamente semelhantes em FN e LAM, validando o revestimento FN para estudar in vitro as morfologias dos mioblastos C2C12 durante o processo de fusão/diferenciação.
quantificámos o índice de forma celular (CSI) que caracterizou a morfologia dos mioblastos, dando informações sobre o alongamento celular. Células arredondadas têm um CSI perto de 1, enquanto células alongadas têm um CSI perto de 0. Encontramos CSI variando de 0,1 a 0,8 com um valor médio de 0.37 ± 0, 15( n = 101), sugerindo uma grande variabilidade nas morfologias celulares (Fig. 1B). Os mioblastos exibiram um perímetro médio de 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) e ampla gama de áreas de propagação( de ~1000 a ~4000 µm2), com um valor médio de 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Estes achados obtidos em mioblastos C2C12 foram reforçados através da realização de medições morfológicas adicionais (CSI, perímetro celular e área celular) em mioblastos humanos primários (16úbicos, Figo suplementar. 2-a) que vêm dos bíceps de um paciente não afetado pelo FSHD (i.e. que foram confirmados para a falta de uma supressão 4qA). Como indicado na figura complementar. 2B–D, os nossos resultados demonstram que o CSI de 16UBic mioblastos variou de 0,14 a 0,86, com um valor médio de 0,44 ± 0.17 (n = 90), o que sugere uma grande variabilidade na célula morfologias de mioblastos humanos, como observado para as células C2C12. Em conjunto, os nossos resultados demonstram que a variabilidade das morfologias celulares não depende do tipo de célula nem de qualquer artefacto da cultura celular.em seguida, estudamos a distribuição de filamentos de actina numa população de mioblastos C2C12 para entender se as áreas de disseminação da variabilidade podem modular o citoesqueleto de actina. As nossas descobertas mostraram que a intensidade total de fluorescência da rede de F-actina estava linearmente relacionada com a área celular (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0.748), sugerindo que quanto maior a propagação do mioblast, mais filamentos de actina são formados. Como indicado na figura complementar. 3, em seguida, caracterizamos a distribuição de adesões contendo vinculina para determinar como variações da forma celular afetam as interações de substrato celular em mioblastos C2C12. Descobrimos que a área total de adesões de substrato celular por célula aumentou com a área celular (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0, 783) e com a intensidade de fluorescência de F-actina(Fig. 1G). Nossos resultados indicam que os mioblastos C2C12 assumem uma variedade de formas celulares e áreas de disseminação, mas, por sua vez, adaptar tanto a quantidade de filamentos de actina e adesões de link para a sua propagação. Para obter mais informações sobre o papel da forma celular na diferenciação de mioblastos, em seguida, consideramos a evolução da razão de aspecto celular durante a proliferação (P0 a 6 horas e P2 a 48 horas) e os estágios de diferenciação (D2 a 96 horas) (Fig. 1H). Como mostrado na Fig. 1I, J, as nossas descobertas mostram que os mioblastos aumentaram a sua relação de aspecto de 0.40 ± 0.16 (P0) para 0.36 ± 0.09 (P2) e 0.24 ± 0.07 (D2), sugerindo que os mioblastos elongam significativamente e adoptam uma relação de aspecto de 1:4 para diferenciar. Além disso, nossos resultados indicaram que as fibras de estresse de actina eram altamente orientadas em D2 (Fig suplementar. 4A, B), correspondente também a alongamentos nucleares significativos (Fig. suplementar. 4C). Em conjunto, as nossas descobertas mostram que a rede F-actin é modulada por modificações da morfologia do mioblastos e indicam que a diferenciação dos mioblastos requereu um alongamento celular até uma proporção de 1:4.
a organização espacial da rede actin e do núcleo é dirigida pela morfologia do mioblast
controlamos a variabilidade intrínseca das morfologias do mioblast usando micropatterns adesivos para padronizar as suas Áreas de propagação e controlar as suas formas. Usando uma tecnologia de impressão de microcontacto20, criamos micropatterns Adesivos de fibronectina (FN) com uma área constante de 1600 µm2 e geometrias diferentes. Usámos arredondado( CSI = 1), quadrado( CSI = 0.79), triangular (CSI = 0.60) e diferentes proporções de aspecto rectangular (CSI = 0.50 e 0.34 para 1: 4 e 1:7 proporções de aspecto, respectivamente) micropatterns FN para mioblastos individuais de cultura (Fig. 2A). Estas diferentes geometrias de micropatterns permitiram padronizar in vitro a forma de myoblast sobre uma ampla gama e controlar sua área de propagação.
Para determinar quantitativamente a função da célula de geometria espacial organização do citoesqueleto de actina, determinou-se a orientação dos filamentos de actina para cada célula shape34,35. Os filamentos de actina manchado com a faloidina foram codificados por cores em função de sua orientação com um gradiente de cor que vão do azul claro quando os filamentos de actina foram organizados em paralelo (0°) para o eixo horizontal e vermelho (+90°) ou laranja (-90°) para as organizadas perpendicularmente ao eixo horizontal (Fig. 2B). Observamos que os filamentos de actina em células arredondadas foram distribuídos aleatoriamente, com orientações que variam de -90° a +90°. As células quadradas exibiam filamentos de actina organizados em três principais domínios angulares.: 0 ° a 25°, 50 ° a 90° e -50° a -90°, enquanto as células triangulares mostraram filamentos de actina organizados principalmente de acordo com os três lados do padrão a 0°, 60° e -60°. Curiosamente, descobrimos que os filamentos de actina eram altamente orientados paralelamente ao eixo das células longas (0°) para as células rectangulares de 1:4 (CSI = 0.50) e 1:7 (CSI = 0.34). A quantificação das adesões que contêm vinculina não indicou diferenças estatísticas de zonas de adesão entre morfologias celulares (Fig. complementar. 5A-C), enquanto que a orientação das adesões focais foi modulada pela forma celular (Fig. suplementar. 5D, E), conforme observado para filamentos de actina. Os nossos achados mostram que tanto os mioblastos retangulares 1:4 como 1:7 permitem uma organização mais forte do citoesqueleto de actina (Fig. 2C) e adesões focais, sugerindo que o alongamento do mioblast leva à formação de dipolos contrácteis.considerando o papel do núcleo celular na diferenciação dos mioblastos em miotubos, investigamos em seguida se as mudanças na forma celular e arquitetura do citoesqueleto podem modular a forma e orientação do nucleus36. Descobrimos que a relação de aspecto nuclear aumentou significativamente com a redução do CSI (Fig. 2D). De fato, células arredondadas (CSI = 1) circular micropatterns mostrou um núcleo arredondado caracterizado por uma média de proporção de 1,11 ± 0.06, considerando que células rectangulares com uma proporção de 1:4 (CSI = 0.50) e 1:7 (CSI = 0.34) exibiu grande nuclear deformações com as proporções de aspecto de 1,39 ± 0,21 e 2.19 ± 0.23, respectivamente. Também notamos que a orientação do núcleo foi modulada pela morfologia celular (Fig. 2E). Descobrimos que a orientação do núcleo arredondado, quadrado e triangular células estende por uma vasta gama de ângulos (de ~15° ~60°), com uma orientação média de ~40° (circular n = 11), ~33° (quadrado, n = 14) e ~43° (triângulo, n = 10) em relação ao eixo horizontal. Para células retangulares, nossos resultados indicaram que o núcleo era orientado paralelamente ao eixo celular com um ângulo médio de ~14° (1:4, n = 15) e ~2° (1:7, n = 10).
o alongamento celular aumenta a contractilidade do mioblast
a próxima questão que abordámos foi como as alterações na forma celular afetam a contractilidade do mioblast. Para responder a esta pergunta, usamos microscopia de força de tração (TFM) para determinar as tensões de tração exercidas por myoblastos micropatterados. Como mostrado na Fig. 3A observamos que as tensões máximas foram exercidas nas extremidades dos mioblastos micropatterados, independentemente da forma celular. Como observado anteriormente em outra célula types37, contrátil stress acumulado, de preferência nos cantos (quadrados e triângulos) ou em ambas as extremidades (1:4 e 1:7 retângulos) de micropatterned mioblastos. Quantificámos o stress total exercido pelos mioblastos micropatterados individuais para determinar se a morfologia celular modula a contractilidade celular. Como mostrado na Fig. 3B, as células arredondadas (CSI = 1) exerceram uma tensão total de 170.7 ± 46.4 N/m2, enquanto as células rectangulares (CSI = 0.34, proporção 1:7) exerceram uma maior quantidade total de tensões (295.9 ± 156.8 N / m2), sugerindo que formas de células alongadas levam a um aumento das tensões de tracção. Além disso, descobrimos que as células rectangulares (CSI = 0.34, proporção 1:7) exibiam o maior valor máximo de estresse (684.3 ± 257.8 Pa, Fig. 3C), enquanto que os mioblastos arredondados mostraram o valor máximo de estresse mais baixo (351,5 ± 123,6 Pa). Considerando que as tensões contrácteis foram exercidas na periferia celular e que a redução do CSI leva a um aumento das tensões de tração, nós traçamos o valor máximo de estresse como uma função da distância do centro de massa para a extremidade da célula (Fig. 3D), que representa 22,6 µm (CSI = 1), 28.28 µm (CSI = 0.79), 33.98 µm (CSI = 0.60), 41.23 µm (CSI = 0.50) e 53.45 µm (CSI = 0.34). Como mostrado na Fig. 3D, descobrimos que o estresse contractil máximo aumentou linearmente com a distância do centroide para a extremidade da célula (R2 = 0.958, n = 65), sugerindo que morfologias alongadas de mioblastos exercem mais forças de tração.
No fim de determinar a contribuição da actomyosin de rede no estabelecimento de contrátil forças em mioblastos, C2C12 células foram tratadas com o G-actina de seqüestro de drogas Latrunculin B (LatB) e com a miosina II inibidor Blebbistatin (Bolha). Os mioblastos imunodetidos com falloidina indicaram que as células tratadas com LatB e Bleb apresentavam uma rede de actina difusa(Fig. 3E), demonstrando que ambas as drogas afetaram significativamente a organização da F-actin. Usámos TFM em mioblastos micropatterados tratados com ambas as drogas para determinar o papel da rede actomiosina no estabelecimento de forças contracteis em mioblastos de diferentes geometrias. Os nossos achados indicam que o tratamento com LatB induziu uma perda significativa de contractilidade, que aumentou com o alongamento celular. De facto, as células arredondadas mostraram uma perda de stress contractil de ~62%, enquanto as células rectangulares 1:4 e 1: 7 tratadas com LatB foram caracterizadas por uma perda de stress contractil de ~88% e ~86%, respectivamente (Fig. 3F). Além disso, descobrimos que o stress contractil de 1:4 células retangulares tratadas com Bleb foram caracterizadas por uma perda de cerca de 80% da força contráctil, demonstrando que os motores moleculares de miosina II são os principais jogadores das forças contrácteis de mioblast.estes resultados indicam que a contractilidade da rede actomiosina é aumentada em mioblastos alongados através do estabelecimento de uma densa rede de fibras de actomiosina paralelas.
a contractilidade dos pares de células aumentou após a sua fusão e aumentou em micropatterns alongados
para compreender como a morfologia do mioblast pode afectar as propriedades contracteis dos miotubos, consideramos um modelo mínimo de dois mioblastos. Determinamos primeiramente as forças de tração exercidas por dobradiças celulares em P1 (24 h em meios de proliferação) banhadas em micropatteros de formas variadas (Figo suplementar. 6A). Não houve diferenças estatísticas de stress contractil entre a vasta gama de CSI (Figo suplementar. 6B), apesar de uma orientação bem definida da rede actin (Fig suplementar. 6C) e os núcleos (Supplementary Fig. 6D, E)em micropatterns rectangulares 1:4 e 1:7. Com base nesta observação, quantificamos então a tensão contractil exercida por dobradiças celulares cultivadas em micropatteros circulares (CSI = 1) e Retangulares (CSI = 0.50, 1:7) FN durante cinco dias adicionais (D5, Fig. 1H) em meio de diferenciação. Nós usamos CMXRos vermelhos MitoTracker (ThermoFisher Scientific), uma coloração mitocondrial viva, para garantir que as dobradiças de mioblast eram fundidas (Fig. 4A) 38. Como mostrado na Fig. 4B,C, verificamos que o total contrátil do estresse foi ligeiramente maior no fundida célula parelhas crescido circular micropatterns (267 ± 64 Pa), comparando a circular ciclo celular parelhas (157 ± 37 Pa), enquanto fundida alongada parelhas foram mais do que duas vezes mais contráteis (543 ± 193 Pa) de ciclo alongada parelhas (211 ± 73 Pa). Estes resultados indicam que a contractilidade celular aumentou após a fusão celular e foi significativamente aumentada para morfologias alongadas.
Actomyosin contratilidade promove myotube diferenciação
Nós, então, perguntou se o actomyosin contratilidade dos mioblastos podem influenciar myotube diferenciação. Os mioblastos C2C12 foram cultivados em substratos revestidos de FN em meios de proliferação durante 2 dias (P2, Fig. 1H) para alcançar a confluência celular. Em seguida, LatB ou Bleb foram adicionados por 30 minutos e o meio de proliferação foi substituído por um meio de cultura de diferenciação. Após 4 dias em meio de diferenciação (D4, Fig. 1H), as células C2C12 foram fixas e manchadas para DNA e TroponinT, um marcador de diferenciação (Fig. 5). Avaliámos o efeito dos tratamentos com LatB e Bleb através da coloração da actinina alfa no controlo dos miotubos (CTRL) e dos miotubos tratados com Latrunculina B (+LatB) e blebbistatina (+Bleb). Como observado na figura complementar. 7, control myotubes apresentam padrões típicos de banda Z estriada, enquanto que os tratamentos LatB e Bleb perturbam os padrões de estriação em myotubes. Os miotubos de controle (CTRL) foram caracterizados por uma razão de aspecto média de 7,99 ± 3,38 (Fig. 5-A) e uma área de troponina T positiva de 51, 7 ± 5, 6% (Fig. 5B). Os nossos resultados indicam que os tratamentos com LatB e Bleb diminuíram a fracção da área da troponina T para 44, 9 ± 5, 2% e 44, 4 ± 5, 1%, respectivamente. Além disso, descobrimos que o índice de fusão foi estatisticamente menor para as células tratadas com LatB (27 ± 3%) e com Blebb (29 ± 3%) do que para as células de controlo (38 ± 5%), reforçando o papel da contractilidade de actomiosina na diferenciação do mioblast (Fig. 5C). Em conjunto, estes resultados indicaram que a contractilidade actomiosina dos mioblastos promove a diferenciação dos miotubos.
Myoblast alongamento dispara YAP nuclear de exportação, o que é essencial para a diferenciação de mioblastos em myotubes
Para obter mais informações sobre o intracelular mecanismos que controlam o myotube diferenciação, consideramos o papel YAP, por determinação de sua localização no citoplasma ou no núcleo de mioblastos, onde ele se liga e ativa a TEAD transcrição factors39. Para este fim, quantificámos a razão yap citoplásmica / nuclear em mioblastos micropatterados(Fig. 6A e Figo suplementar. 8). Alongamento celular em 1:Os micropatterns rectangulares 4 e 1: 7 aumentaram a razão yap citosólica / nuclear(Fig. 6B), sugerindo que o alongamento celular desencadeia a exportação nuclear de YAP através de forças de compressão nuclear exercidas pela rede actomyosin40. Para verificar se a localização YAP, no citoplasma ou no núcleo está relacionado com fases específicas do processo de diferenciação, nós manchada YAP em células C2C12 após 24 h (P1) e 48 h (P2) da proliferação passo e às 96 h (D2) e 264 h (D9) a diferenciação etapa (Fig. 6C e Figo suplementar. 9). Curiosamente, nossos resultados indicaram que o citoplasmática/nuclear YAP taxa de aumento de 0,37 ± 0.07 em P1 para 0,68 ± 0.06 P2 e 0,67 ± 0.06 no D2 e, em seguida, diminuiu para 0,42 ± 0.10 no D9 (Fig. 6D). Curiosamente, a razão de YAP citoplásmica/nuclear Em D9 Não foi estatisticamente diferente dos valores de P1, sugerindo que a razão de Yap citoplásmica/nuclear em miotubos diferenciados é semelhante à dos mioblastos. Para verificar esses resultados, colhemos mioblastos na fase de proliferação P1 (24 h) e na fase de diferenciação D2 (96 h) E isolamos seus materiais citoplásmicos e nucleares. Realizámos um ensaio de proteína do ácido bicinchonínico (BCA) e as proteínas contidas nas extracções citoplásmicas e nucleares foram analisadas por electroforese (Fig. 6E). Os nossos resultados do Western blot indicaram que a razão citoplasmática/nuclear YAP aumentou de 0, 62 ± 0, 08 no P1 para 0, 87 ± 0, 24 no D2 (Fig. 6F). Esta quantificação bioquímica da YAP demonstrou uma exportação nuclear significativa da YAP em diferenciar as células C2C12 e fortalecer as nossas descobertas.
com base nestes resultados, avaliámos o papel do YAP usando a leptomicina B para bloquear a exportação activa do núcleo, ligando-se directamente à exportin141. De facto, Alberto Elosegui-Artola e colegas de trabalho demonstraram recentemente que a leptomicina B (LMB) pode ser utilizada de forma eficiente para estudar a forma como as forças contrácteis exercidas pela translocação nuclear de YAP conduzem o citosqueleto 39. Ao tratar mioblastos C2C12 em P2 (48 h) com LMB, descobrimos que a razão citoplasmática para yap nuclear foi significativamente menor nas células tratadas com LMB em D2 (96 h, Fig. 6G), sugerindo que o YAP está concentrado principalmente no núcleo quando a exportação nuclear é inibida. Além disso, as nossas descobertas indicaram que o índice de fusão em D4 das células tratadas com LMB (Fig. 6H) foi muito baixo (3, 8 ± 1.5%) em comparação com as células de controlo (42,4 ± 9,1%), demonstrando que a exportação nuclear activa é necessária para a diferenciação C2C12.