Discussão
A imagem de citometria método proposto neste trabalho demonstra a capacidade de rapidamente e de forma eficiente analisar autofagia em células vivas para a triagem de potenciais medicamentos que podem induzir ou inibir autophagic atividades, como a promoção de apuramento de misfolded proteínas associadas a neurodegeneration, ou inibindo a resistência a medicamentos associados com o câncer. A limitação dos métodos atuais pode ser superada por citometria de imagem e reagentes únicos para desenvolver um novo método de detecção de autofagia. A Visão Celular tem sido usada anteriormente para ensaios de células fluorescentes (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), e o corante autofágico Cyto-ID foi mostrado especificamente mancha autofagossomas em células vivas. In this work, the Cyto-ID dye is shown to colonalize with RFP-LC3 in starved HeLa cells, which further validate the specificity of the dye. O método desenvolvido de detecção de autofagia baseado em imagens é aferido com base na citometria de fluxo padrão, comparando os resultados da atividade de autofagia em células Jurkat carentes de nutrientes. Os resultados mostraram um aumento da intensidade fluorescente em células sem nutrientes, e uma diminuição para as células Jurkat recuperadas. No entanto, os valores AAF medidos da citometria de imagem são consideravelmente mais elevados do que a citometria de fluxo, o que pode ser devido a diferenças entre instrumentação e métodos. The Cellometer Vision image cytometer uses a charge coupled device for fluorescence measurement, while the FACS Calibur flow cytometer uses a photo-multiplier tube (PMT). Além disso, o método de análise das intensidades fluorescentes também diferia entre os dois sistemas. O Citómetro de fluxo mede os sinais totais de fluorescência de cada célula, enquanto o sistema de imagem adquire imagens e analisa autofagossomas com manchas fluorescentes dentro das células, o que pode fornecer medições mais precisas da actividade da autofagia. O software do celular pode analisar a fluorescência das células somando os pixels fluorescentes totais em cada célula, ou medindo apenas os pixels de alta intensidade fluorescente a partir de autofagossomas dentro de cada célula. Outra diferença pode ser causada pela tensão de cisalhamento da citometria de fluxo afetando a viabilidade das células-alvo (Robey et al., 2011).o fluxo autofágico é também um doseamento importante para o desenvolvimento de um novo método de detecção. A CQ é empregada para inibir a degradação lisossómica dos autofagossomas, onde a actividade autofágica seria a mais elevada para as células Jurkat sem nutrientes na presença de CQ devido à interacção sinergística entre os tratamentos. A próxima mais alta seria as células Jurkat in starvation sem CQ. Apenas um ligeiro aumento da actividade autofágica seria exibido pelas células Jurkat com CQ apenas em comparação com o controlo devido à acumulação de autofagolisossomas basais. Os resultados do fluxo autofágico obtidos de ambos os instrumentos mostraram tendências semelhantes, mas os valores AAF medidos na citometria de imagem são significativamente mais elevados. Estes resultados demonstraram que o método de detecção citométrica da imagem poderia ser facilmente implementado para examinar a actividade autofágica, apesar das diferenças quantitativas potencialmente específicas do instrumento nos valores AAF.
A fim de demonstrar que a citometria de imagem pode ser uma potencial tecnologia de rastreamento da descoberta de drogas, a capacidade de analisar amostras em múltiplas condições deve ser testada. A citometria de imagem é utilizada para medir a actividade autofágica das células Jurkat tratadas com rapamicina em várias concentrações, para demonstrar a capacidade da citometria de imagem para medir os efeitos dose–resposta ao longo de um estudo de tempo. Como resultado, a citometria baseada em imagens é capaz de detectar as diferenças na atividade autofágica em várias condições experimentais. Em Fig. 8.6, a actividade autofágica (medida pelos valores AAF) é a mais elevada após 18 h de incubação. Uma ligeira diminuição dos valores de AAF é mostrada entre 8 e 4 h de incubação, o que pode ser devido a não permitir que as células recuperem completamente após o tratamento inicial do fármaco. Além disso, células aderentes, como a linha celular de câncer de próstata humana (PC-3), também podem ser medidas usando o método de citometria de imagem. A resolução de imagens da Visão Celular pode analisar autofagossomas com marcação fluorescente (puncta), observados em imagens fluorescentes e em histogramas de intensidade de fluorescência.
é também importante demonstrar a capacidade de caracterizar diferentes compostos medicamentosos comparando o seu efeito autofágico dose–resposta para campanhas de descoberta de drogas. Os efeitos Dose–resposta do tamoxifeno e da rapamicina são directamente comparados utilizando citometria de imagem. Os resultados à incubação de 18 h mostraram que a rapamicina induzia um nível mais elevado de actividade autofágica do que o tamoxifeno. É importante notar que o tamoxifeno a 100 µM é altamente citotóxico, levando à morte e desintegração de células Jurkat após incubação de 18 h. A verificação, com base na imagem, do efeito citotóxico no tamoxifeno em concentrações elevadas pode ser altamente útil para eliminar as incertezas apenas das parcelas de dispersão e dos resultados do histograma.a citometria de imagem demonstrou resultados comparáveis à citometria de fluxo padrão para a análise de células fluorescentes (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). O método de citometria baseado em imagens pode oferecer várias vantagens sobre a citometria de fluxo. Por exemplo, o número de células necessário para cada amostra (10-20 µL) é significativamente inferior a um citómetro de fluxo convencional (300-500 µL). A configuração inicial do citómetro de fluxo exige que algumas das amostras de células-alvo sejam utilizadas para tensões de partículas e ajustamento de compensação. Por outro lado, muitos citômetros de imagem pipetam células para uma câmara de contagem que pode ser revista várias vezes. Assim, as amostras de células-alvo não são desperdiçadas durante a otimização inicial do ajuste e focagem do tempo de exposição. Mais importante ainda, a vantagem de capturar imagens BR e fluorescentes permite aos pesquisadores verificar visualmente os dados de fluorescência adquiridos. Isto pode ajudar a identificar a citotoxicidade como um efeito secundário complicado de um ensaio de tratamento medicamentoso que induz a autofagia.a autofluorescência pode ocorrer usando corante autofágico Verde Citocidiano devido à câmara de contagem de plástico, mas o software pode remover automaticamente o sinal de fundo para obter a fluorescência alvo real sem alterar o cálculo do AAF. Além disso, a fotobleaching de sondas fluorescentes em ensaios baseados em células é minimizada, uma vez que a visão do celular usa LEDs de menor potência em comparação com os lasers de alta potência utilizados em outros instrumentos. Futuro de melhoria para o Cellometer citometria de imagem seria a de desenvolver uma maior taxa de transferência de um sistema automatizado que pode analisar mais células para melhor análise estatística, bem como a capacidade para analisar várias amostras simultaneamente, facilitando maior taxa de transferência de dados baseados em células de drogas triagem de inibidores e ativadores da autofagia, apoptose, necrose, e outros fenómenos fisiológicos de interesse.