diversos conjuntos de motivos especificam actividades não redundantes de ligação do ADN de membros da família AP-1 em macrófagos

análises estatísticas

na Fig. 1c, differences in gene expression was tested using the independent T-test (degree of freedom = 1, two-tailed) on two replicate experiments (n = 2). Genes diferentes expressos na Fig. 1b foram identificados usando EdgeR55 com parâmetros padrão, e usando os cortes FDR < 0.Alteração de 05 e log2 vezes ≥2. Em Fig. 2c, as diferenças entre cada grupo (veh quer, Compartilhados e de KLA 1 h), foram examinados usando independentes teste-T (grau de liberdade = 1, bicaudal); o número de loci em cada grupo para cada monômero são como segue ATF3 (veh quer = 1447, Partilhada = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Significado para motivos na Fig. 4a foi calculado usando o teste da relação de probabilidade (grau de liberdade = 1) comparando as previsões feitas pelo modelo TBA completo e o modelo TBA perturbado em todos os limites loci em macrófagos tratados com Veh para Atf3 (n = 23.160), Jun (N = 15,548) e JunD (n = 19,653). Significado para motivos na figura suplementar. 4C foram calculados utilizando-se o teste de razão de verossimilhança (grau de liberdade = 1) a comparação entre as previsões feitas pelo pleno do TBA modelo e o perturbado TBA modelo em todos os loci ligados por JunD no GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477) e SK-N-SH (38,960). Significado para motivos na Fig. 5b, Figo suplementar. 5B e Figo suplementar. 5C foram calculados utilizando-se o teste de razão de verossimilhança (grau de liberdade = 1) a comparação entre as previsões feitas pelo pleno do TBA modelo e o perturbado TBA modelo em todos os loci ligados em meio líquido tratado macrófagos para Atf3 (n = 36,745), Jun (n = 17,481), JunD (n = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619), e JunB (n = 13,376). Valores significativos para a Fig. 6F e S6F foram calculados utilizando o teste F; o número de loci analisados para monômeros em Veículos-tratados macrófagos são ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004), e JunD (n = 4148); o número de loci analisados para monômeros em KLA-tratados macrófagos são: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477), e JunB (n = 3616).

gerando genoma personalizado para BALB/cJ

um genoma personalizado para BALB / cJ, substituindo posições invariantes do genoma mm10 por alelos relatados pelo projeto genomas do Mouse (versão 3 do arquivo VCF)43. Para C57BL / 6J foi usado o genoma de referência mm10 do navegador de genoma UCSC. Para permitir comparações entre BALB/cJ e C57BL/6J durante a análise, as coordenadas do genoma personalizado para BALB/cJ foram mudadas para corresponder às posições do genoma de referência mm10 usando MARGE34. Nós não analisamos nenhuma leitura que caiu dentro de deleções em BALB / cJ. Lê-se que sobreposto com uma inserção foi atribuído à última posição sobreposta na estirpe de referência.

A análise dos picos do ChIP-seq

a sequenciação de leituras de experimentos do ChIP-seq foi mapeada para a montagem mm10 do genoma de referência do mouse (ou o genoma personalizado BALBc/J) usando a última versão do Bowtie2 com Parametros padrão56. ChIP mapeado-seq lê para identificar sites putativos de ligação TF com o comando HOMER57 findPeaks (com parâmetros-Tamanho 200-L 0-C 0-fdr 0.9), usando o experimento de ChIP de entrada correspondente à condição de tratamento. A fim de reduzir o número de picos falsos positivos, calculamos o IDR em cada pico (usando a versão 2.0.3 do programa idr) com a pontuação Homero peak calculada para cada experiência replicada como a entrada para IDR e, em seguida, filtrado todos os picos que tinham IDR ≥ 0,0558. Os motivos de novo foram calculados com o HOMER findMotifsGenome.pl comando com parâmetros predefinidos. O enriquecimento dos motivos de novo foi calculado utilizando a findKnownMotifs.pl programa em HOMER com parâmetros padrão.

quantificação de leituras de expressão de RNA geradas a partir de experimentos RNA-seq foram alinhados com o genoma de referência do mouse mm10 (ou o genoma personalizado BALBc/J) usando aligner estrela com parameters59 padrão. Para quantificar o nível de expressão de cada gene, calculamos o RPKM com as leituras que estavam dentro de um exon. Onu-normalizado seqüenciamento leituras foram utilizados para identificar diferencialmente expressos genes com EdgeR55; nós considerados genes com FDR < 0,05 e uma alteração na expressão entre duas condições experimentais de duas vezes ou maior diferencialmente expressos. Para quantificar a expressão de RNAs nascentes, anotamos os picos do ChIP-seq com o número de leituras GRO-seq (normalizadas para 10 milhões) que estavam dentro de 500 bps do centro de pico usando o HOMER annotatePeaks.pl comando.

TBA model training

para cada monómero AP – 1 em cada condição de tratamento, treinámos um modelo para distinguir locais de ligação para cada monómero de um conjunto de loci genómico seleccionado aleatoriamente. O conjunto de loci de fundo aleatório utilizado para treinar cada modelo foi seleccionado de acordo com os seguintes critérios: (1) a distribuição de conteúdo de GC do loci de fundo corresponde ao conteúdo de GC dos locais de ligação para um determinado monómero, (2) não contém posições ambíguas ou inacessíveis, e (3) O número de sequências de fundo corresponde ao número de locais de ligação K. Para cada uma das sequências no conjunto combinado dos sites de ligação e loci de fundo, calculamos a maior pontuação log-odds (também referida como pontuação motif) para cada um dos motivos n que serão incluídos nas correspondências model60 Motif em ambas as orientações foram consideradas. Log-odds pontuações inferiores a 0 foram definidas para 0. Por procedimentos padrão de pré-processamento antes de treinar um modelo linear, padronizamos as pontuações log-odds para cada motivo, dimensionando o conjunto de pontuações para cada motivo de modo que o valor médio é 0, e a variância é 1. A padronização escala as pontuações para todos os motivos para a mesma faixa (os motivos mais longos têm uma pontuação máxima maior) e também ajuda a reduzir o efeito da multi-collinearidade no treinamento do modelo. E assim, as características usadas para treinar nosso modelo é uma matriz n Por 2k de log-odds de pontuação padronizada em cada linha. Para gerar a matriz correspondente de etiquetas, atribuímos a cada site de ligação uma etiqueta de 1 e cada loci de fundo uma etiqueta de 0. Usando esta matriz de recursos, e matriz de etiquetas, treinamos pesos para cada motivo usando um modelo de regressão logística L1 penalizado como implementado pelo scikit-learn Python package61. Pesos Motif mostrados em nossa análise são os valores médios em cinco rodadas de validação cruzada, usando 80% dos dados para treinamento e 20% para testes em cada rodada. Modelos foram treinados para chips-seqs gerados neste estudo, bem como dados baixados do NCBI Gene Expression Omnibus (número de adesão GSE46494) e do ENCODE data portal (https://www.encodeproject.org).

quantificação de colinearidade múltipla

para avaliar a extensão da multi-colinearidade nas características de pontuação motif que usamos para treinar os nossos modelos, pegamos cada matriz de funcionalidade correspondente a cada experiência e calculamos a VIF para cada motivo 38. Para calcular o VIF, primeiro determinamos o coeficiente de determinação, R2, para cada motivo, regredindo as pontuações de log-odds para um motivo contra as pontuações de log-odds dos motivos restantes. Em seguida, utilizando o coeficiente de determinação, a tolerância para cada motivo pode ser calculada como a diferença entre 1 e o coeficiente de determinação (1 − R2). O VIF é o recíproco da tolerância \(\frac{1}{{1-r^2}}\). Nós usamos o módulo linear_ model Do pacote sklearn Python para calcular o coeficiente de determinação.

agrupar e fundir

marcámos a semelhança de todos os pares de motivos de sequência de ADN calculando a correlação de Pearson das matrizes de probabilidade de posição alinhadas (PPMs) correspondentes a um dado par de motivos 62. A correlação de Pearson para um par de motivos A e B de comprimento e é calculado usando a fórmula:

PPMs primeiro foram alinhadas usando o Smith–Waterman alinhamento algorithm63. Motivos mais curtos são acolchoados com valores de frequência de fundo antes do alinhamento. As lacunas no alinhamento não foram permitidas e cada posição no alinhamento foi marcada com a correlação de Pearson. A correlação de Pearson foi então calculada usando o alinhamento ideal. Em seguida, conjuntos de motivos que têm PPMs com uma correlação de Pearson de 0,9 ou maior foram fundidos por interativamente alinhando cada PPM dentro do conjunto, e, em seguida, a média das frequências dos nucleótidos em cada posição.a avaliação da significância dos motivos para TBA

valores p para TBA foram calculados utilizando o teste da razão log-probabilidade. Cada motivo foi removido do conjunto de recursos usados para treinar um modelo TBA perturbado (usando cinco vezes a validação cruzada). Nós então usamos o modelo completo (contendo todos os motivos) e o modelo perturbado para calcular a probabilidade de observar a ligação em todos os locais de ligação e sequências de fundo para um dado monômero e todas as regiões de fundo. A diferença entre os likelihoods calculada pelo modelo completo e o modelo perturbado foi então usada para realizar o teste chi-quadrado para cada motivo. O teste chi-quadrado foi realizado usando o scpy python package64.

comparação com outros métodos

BaMM motif e gkm-SVM foram ambos executados com parâmetros padrão. Usámos a versão mais recente da GKM-SVM, LS-GKM (compilada a partir do código-fonte baixado de https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm em 8/25/16), e BaMM motif; v1.0 baixado de https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39,65. Ambos os modelos foram treinados usando cinco vezes a validação cruzada. O desempenho do modelo foi marcado usando funções roc_auc_score e precision_score do módulo métrico do sklearn.

previsão de alterações na ligação AP-1 após um tratamento de uma hora com KLA

para prever a alteração na ligação após o tratamento com KLA, levámos os pesos motif aprendidos para cada um dos motivos n (wn) por um modelo TBA treinado nos dados tratados com veículos (Wveh = ) e um modelo TBA treinado nos dados tratados com 1-h KLA (Wkla = ) para cada monómero AP-1. A alteração prevista na ligação para cada sequência é então a diferença entre o produto Ponto das Pontuações padrão do motivo calculado para a sequência cada um dos locais de ligação k (Sk = ) com os pesos do motivo KLA e o produto Ponto das Pontuações do motivo e os pesos do motivo Veh (Δkla−veh,k = Wkla⋅Sk − Wveh⋅Sk). Previsões foram feitas para todos os loci genômicos que se cruzaram com um pico para um dos monômeros AP-1 em ambos os veículos ou condição de tratamento KLA.

Previsão de deformação específica de vinculação com o TBA

Para prever a tensão-ligação específica, que alavancou o motivo de pesos aprendidas para cada um dos n motivos (wn) por um TBA modelo (W = ) para cada AP-1 monômero usando o C57BL/6J de dados, e o motivo de escores calculados para cada um dos k sítios de ligação usando a seqüência genômica para C57BL/6J e BALBc/J (SC57,k = , SBAL,k = ). De seguida, calculamos a diferença de que o motivo de pontuações para C57BL6/J e BALBc/J (Dn = ) e, em seguida, padronizado a pontuação diferenças para cada motivo de todos os k sítios de ligação que tinha uma mutação ao comparar BALBc/J para C57BL/6J, produzindo padronizado motivo de pontuação diferenças para cada sítio de ligação (Zn = padronizar(Dn) = ). Finalmente, fizemos então uma previsão para a ligação específica da estirpe, computando o produto dot dos pesos motif e a diferença padronizada das Pontuações motif entre C57BL6/EiJ e BALBc/J para o local de ligação mutado KTH (ΔC57-BAL = W⋅).

TBA-2Strain modelo de formação

Para cada loci do genoma que se cruzaram com um pico para um dos AP-1 monômeros, em C57BL/6J ou BALBc/J, foi calculado o mais alto log-odds pontuação para cada um dos n motivos, que serão incluídos no modelo, utilizando a seqüência genômica de ambas as linhagens, produzindo um dois conjuntos de motivo de pontuação para cada um dos k sítios de ligação (SC57,k = , SBAL,k = ). Motivos coincidem em ambas as orientações foram considerados. Log-odds pontuações inferiores a 0 foram definidas para 0. Usando as pontuações do motivo, calculamos a diferença padronizada das Pontuações do motivo nas duas estirpes descritas na seção acima (Zn = ). E assim, as características usadas para treinar nosso modelo é uma matriz n Por k de log-odds de pontuação padronizada em cada linha. Em seguida, calculamos a razão log2 vezes do número de ChIP-seq lê em C57BL / 6J em comparação com BALBc / J para representar a extensão da ligação específica da estirpe. Usando esta matriz de recursos, e definindo a razão log2 de ligação entre as duas estirpes como a variável dependente, treinamos pesos para cada motivo usando regressão linear como implementado pelo pacote python scikit-learn. Pesos Motif mostrados em nossa análise são os valores médios em cinco rodadas de validação cruzada, usando 80% dos dados para treinamento e 20% para testes em cada rodada. As previsões para a ligação específica da estirpe podem ser feitas utilizando os pesos calculados de acordo com o procedimento na secção anterior.as proteínas A E G de Dynabeads 50/50 de Invitrogen são processadas por ChIP (10001D, 10003D). A mistura IP consiste em 20 µL de esferas/2 µg de anticorpos por 2 milhões de células ChIP. Anticorpos contra os membros da família AP-1 foram escolhidos para atingir regiões não conservadas para minimizar o potencial de ligação não específica. Os anticorpos estão listados na tabela complementar 3. Para preparação, as esférulas foram lavadas com 2× 0.5% de BSA–PBS, em seguida, os anticorpos de esférulas foram incubados com 0.5% de BSA–PBS durante pelo menos 1 h na rotadora (4 °C). Lavar 2× com 0.5% BSA-PBS, ressuspendidos em tampão de diluição (1% Tritão, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7, 4), 1× inibidores da Protease). Crosslinking duplo para ChIP: o meio foi decantado a partir de células em placas de 10 cm, lavar uma vez brevemente com PBS (RT). O glutarato de disuccinimidilo (Pierce Cat # 20593) (diluído em DMSO a 200 mM)/PBS (RT) foi utilizado durante 10 minutos. Em seguida, o formaldeído foi adicionado a uma concentração final de 1% por mais 10 minutos. A reacção foi apagada com 1: 10 1 m Tris pH 7.4 no gelo. As células foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS a frio, girando a 1000 × g durante 5 minutos. Isolamento e sonificação dos núcleos: ressuspender pellets celulares em 1 mL de tampão de isolamento dos núcleos (Tris–pH 8,0 mM, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI e incubar no gelo durante 10 minutos. Centrifugar 2000 × g durante 3 minutos a 4 ° C. Ressuspender os núcleos em 200 µL de tampão de lise fresco (0,5% sdds, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonication: núcleos foram então sonicados (10 milhões de células) por 25 minutos em um Biorupter (configurações = 30 s = On, 30 s = Off, Medium) usando tubos de parede finos (Diagenode Cat# c30010010). Após sonicação velocidade máxima de rotação durante 10 minutos a 4 °C. preparação do ChIP: O ADN sonicado foi diluído 5× com 800 tampões de diluição (1% Tritão, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7.4), 1× inibidores da protease). Remove-se uma alíquota para as amostras de entrada (5%). Amostras a 4 ° C em rotação. Lavagem: o ChIP é lavado 1× com TSE I (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× com TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7.4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoxicolato, 1 mM EDTA), 1× Com TE + 0.1% Triton X-100, transferência para novo tubo e depois lavar outra vez com TE + 0.1% Triton X-100. Eluição: Eluir com 200 µL de tampão de eluição (1% SDS, 10 mM Tris pH 7.5) durante 20 minutos em RT, agitando sobre o vórtice ou um nutador ou rotador. Descriculação: adicionar 10 µL de NaCl 5 M e incubar a 65 °C (ou, pelo menos, 8 h). Limpar amostras usando o ADN do ChIP Zymo limpo e concentrador. Eluto em 100 µL. Toma 40 µL e segue para o protocolo de preparação da biblioteca.isolamento e fragmentação do ARN-PolyA isolamento e fragmentação do ARN-p: o ARN foi isolado utilizando o reagente de TRIZOL (Ambion cat# 15596018) e o kit de mini-preparação para ARN-ZOL directo (cat# 11-330MB). Isolamento RNA poli-A: utilizar 0.2 RNA total como material de partida para a eficiência de mapeamento ideal e clonalidade mínima. Recolher 10 µL oligo (dT) (NEB cat# S1419S) por amostra de ARN. As esferas foram lavadas duas vezes com 1× DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7, 5, 1 m LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0, 1% Triton X-100). As contas foram ressuspendidas em 50 µL de 2× DTBB. 50 µL de esferas foram misturados com 50 µL de ARN e aquecidos a 65 ° C durante 2 minutos. As contas RNA-beads foram então incubadas durante 10 minutos na TR enquanto rodavam. As contas RNA – HCl foram então recolhidas num íman e lavadas 1× cada uma com RNA WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7.5, 0.12 m LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LDS, 0.1% Triton X-100) e WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7, 5, 0, 5 M LiCl, 1 mM EDTA). Adicionar 50 µL de Tris–HCl pH 7.5 e aquecer a 80 °C durante 2 minutos ao eluto. Recolher RNA e realizar uma segunda colecção de contas oligo-dT. Depois de lavar a segunda coleção, em vez de eluição foi 1× com 1× first strand buffer; 250 mM Tris–HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentação: adicionar em seguida 10 µL de 2× primeiro tampão da cadeia mais 10 mM DTT e fragmento de ADN a 94 °C durante 9 minutos. Recolher contas no íman e transferir eluato contendo mRNA fragmentado para uma nova tira PCR. Deve recuperar 10 µL de ARN fragmentado. First strand synthesis: we mixed fragmented RNA with 0.5 µL random primer (3 µg/µL) Life Tech #48190-011, 0.5 µL oligo-dT (50 µM from SSIII kit), 1 µL dNTPs (10 mM Life Tech, cat 18427088) and 0.5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Cat#AM2696) and heat 50 °C for 1 min. Coloque imediatamente no gelo. Adicionamos então 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL actinomicina (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL DTT (100 mM Life Tech cat# P2325), 0,2 µL de 1% Tween e 0,5 µL de Superscript III e incubamos 25 °C durante 10 minutos, e depois 50 °C durante 50 minutos. Limpeza de contas: Adicionámos 36 µL de RNAClean XP (Ampure XP) e misturámos, incubando durante 15 minutos no gelo. As contas foram então coletadas em um íman e lavadas 2× com 75% de etanol. Em seguida, as contas foram secas ao ar durante 10 minutos e o eluto com 10 µL de H2o sem nuclease. segunda síntese da cadeia. 10 µL de cDNA/RNA foi misturado com 1,5 µL de 10× Azul Buffer (Enzymatics cat# B0110L), 1 µL de dUTP/mistura de dntp mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), de 0,1 µL de dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), de 0,2 µL de RNase H (5 U/µL Enzymatics cat# Y9220L), 1 µL de DNA polimerase I (10 U/µL Enzymatics cat#P7050L), de 0,15 µL de 1% Tween-20 e 1.5 µL de água sem nucleases. A reação foi incubada a 16 °C por 2,5 h. Talão de limpar: o DNA foi purificado por adição de 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) por reação em 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% concentração final) e incubando no RT por 10 min. As contas foram então recolhidas num íman e lavadas 2× com 80% de etanol. As contas foram secas ao ar durante 10 minutos e eluídas em 40 µL de água sem nucleases. O ADN está pronto para a preparação da biblioteca.

Library prep protocol

dsDNA end repair: misturámos 40 µL de ADN a partir de protocolos de ChIP ou RNA com 2,9 µL de H2O, 0.5 µL de 1% Tween-20, 5 µL de 10× T4 ligase (buffer de Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL de mistura de dntp mix (10 mM Affymetrix 77119), de 0,3 µL de T4 DNA pol (Enzymatics P7080L), de 0,3 µL de T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL de Klenow (Enzymatics P7060L) e incubadas por 30 min a 20 °C. 1 µL de Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) em 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) foi adicionado e incubado por 10 min. Limpeza de contas: contas foram coletadas em um íman e lavadas 2× com 80% de etanol. As contas foram secas ao ar durante 10 minutos e depois eluídas em 15 µL ddH2O. dA-Tailing. O ADN foi misturado com 10.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blue Buffer (Enzymatics cat# B0110L), 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) e incubado durante 30 minutos a 37 °C. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 m NaCl (13% final) foi adicionado um incubado durante 10 minutos. Então a limpeza foi feita. As contas foram eluídas em 14 µL. Ligadura do adaptador em Y. A amostra foi misturada com 0,5 µL de um adaptador de código de barras Bio (BIOO Scientific cat# 514104), 15 µL de tampão de ligação rápida (enzimática cat@ L603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 e 0.5 µL de T4 DNA ligase HC (Enzymatics L6030-HC-L) e incubadas por 15 min a RT. 7 µL de 20% PEG8000/2,5 M NaCl foi adicionado e incubado por 10 min a RT. Cordão limpar foi realizada e as contas foram eluídas em 21 µL. 10 µL foi então usado para amplificação PCR (14 ciclos) com iniciadores IGA e IGB (AATGATACGGCACCACCGA, CAAGAAGACGCATACGA).

GRO-seq

transcrição nascente foi capturada pela sequenciação nuclear global (GRO-seq). Os núcleos foram isolados a partir de TGEMs usando lise hipotônica (Tris-HCl 10 mM (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% de IGEPAL CA-630) e ultracongelados em tampão de congelação GRO (Tris–HCl de 50 mM (pH 7.8), MgCL2 de 5 mM, 40% de glicerol). Executar. 3-5 × 106 BMDM núcleos foram executados com BrUTP rotulados de NTPs com 3× NRO buffer (15 mM de Tris–Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM de DTT, 450 mM de KCl, De 0,3 U/µL de SUPERase No, De 1,5% Sarkosyl, 366 µM de ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) e 1,2 µM CTP (Roche, para limitar a execução no comprimento ~40 nucleotídeos)). As reacções foram interrompidas após 5 minutos por adição de 500 µL de reagente LS de Trizol (Invitrogénio), indexado durante 5 minutos e RNA extraído e precipitado como descrito pelo fabricante. Os pellets de ARN foram ressuspendidos em 18 µL de ddH2O + 0,05% Tween (dH2O + T) e 2 µL de mistura de fragmentação (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7.5)), incubados em seguida a 70 °C durante 15 minutos. A fragmentação foi interrompida por adição de 2,5 µL de EDTA de 100 mM. Enriquecimento BrdU. O enriquecimento com BrdU foi realizado utilizando anticorpos BrdU (IIB5) e contas de CORRENTE ALTERNADA (Santa Cruz, sc-32323 AC, lote #A0215 e #C1716). As esferas foram lavadas uma vez com tampão de ligação GRO (0,25× salino-fosfato de sódio-EDTA (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl, seguidas de três lavagens em tampão de ligação GRO e ressuspendidas como 25% (vol/vol) de chorume com 0,1 U/µL de SUPERase-in. Para fragmentar o ARN, foram adicionados 50 µL de tampão de ligação GRO a frio e 40 µL de esferas de anticorpos de BrdU equilibrados e as amostras foram lentamente rodadas a 4 °C durante 80 minutos. As contas foram posteriormente fiadas a 1000 × g durante 15 s, sobrenadantes removidos e as contas transferidas para uma coluna MC Millipore Ultrafree (UFC30HVNB).; Millipore) em 2 × 200 µL de tampão de ligação GRO. A reacção IP foi lavada duas vezes com 400 µL de tampão de ligação GRO antes de o ARN ser eluído por incubação em 200 µL de Trizol LS (Termofisor) sob agitação suave durante 3 minutos. A eluição foi repetida uma segunda vez, adicionando-se 120 µL de dH2O + T para aumentar o sobrenadante e extraído conforme descrito pelo fabricante. Reparação e decapagem da extremidade: para reparação e decapagem da extremidade, os pellets de ARN foram dissolvidos em 8 µL TET (Tris-HCl 10 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, 0,05% Tween 20) por vórtice vigorosa, aquecida a 70 °C durante 2 minutos e colocada sobre gelo. Depois de uma rápida rotação, 22 µL de Reparação de master mix (3 µL 10× PNK buffer, de 15,5 µL dH2O + T, de 0,5 µL SUPERase-Na Inibidor de RNase (10 U), 2 µL de PNK (20U), 1 µL de RppH (5U)) foi adicionado, misto e incubadas a 37 °C por 1 h. Para phosphorylate a 5’end, de 0,5 µL 100 mM ATP, posteriormente, foi adicionado e as reações foram incubadas por mais 45 min a 37 °C (alta concentração de ATP supre RppH atividade). Após a reparação final, foram adicionados 2,5 µL de EDTA de 50 mM, as reacções misturadas e depois aquecidas a 70 °C durante 2 minutos antes de serem colocadas no gelo. Foi realizado um segundo enriquecimento com BrdU, tal como descrito acima. Os pellets de RNA foram dissolvidos em 2,75 µL TET + 0,25 µL Illumina TruSeq 3’Adapter (10 µM), aquecidos a 70 °C durante 2 minutos e colocados no gelo. Foram adicionados 7 de 3’master mix (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA tampão ligase, 0,25 µL SUPERase-In, 1 µL T4 RNA Ligase 2 truncada (200U; NEB)), bem misturado e reacções incubadas a 20 °C durante 1 h. As reacções foram diluídas por adição de 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, aquecidas a 70 °C durante 2 minutos, colocadas no gelo e foi realizada uma terceira ronda de enriquecimento por Bruto. Os pellets de RNA foram transferidos para as tiras de PCR durante a lavagem a 75% de etanol e secos. As amostras foram dissolvidas em 4 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7.5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM de transcrição reversa (RT) primer. Para anelar o RTprimer, a mistura foi incubada a 75 °C durante 5 minutos, 37 °C durante 15 minutos e 25 °C durante 10 minutos. Para ligar o adaptador de 5 ‘Illumina TruSeq, adicionaram-se 10 µL 5’master mix (1,5 µL dH2O + 0,2% Tween 20, 0.25 µL desnaturado Adaptador de 5’ Rtruseq (10 µM), 1,5 µL 10× T4 RNA tampão ligase, 0.25 µL SUPERase-In, 0.2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, 0.5 µL T4 RNA ligase 1 (5U; NEB)) e incubaram-se reacções a 25 °C durante 1 h. Transcrição reversa foi realizada utilizando Protoscript II (NEB) (4 µL de 5× NEB FirstStrand buffer (NEB; E7421AA), de 0,25 µL SUPERase-No, de 0,75 µL Protoscript II (150U; NEB)) a 50 °C por 1 h. Após a adição de 30 µL de PCR master mix (25 µL de 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), de 0,2 µL 100 µM forward primer, 2.8 µL 5 M betaína e 2 µL de 10 µM individuais de código de barras primer), as misturas foram amplificados (95 °C por 3 min, (95 °C por 60 s, 62 °C por 30 s, 72 °C por 15 s) x13, 72 °C por 3 min). As reacções PCR foram limpas utilizando 1,5 volumes de Cabeças de velocidade (GE Healthcare) em 2,5 m NaCl/20% PEG8000. O tamanho das bibliotecas foi selecionado na página / TBE gels para 160-225 pares de base. As fatias de Gel foram trituradas girando através de um tubo de PCR perfurado de 0, 5 mL colocado em cima de um tubo de 1, 5 mL. Foram adicionados 150 µL de Gel EB (0,1% LDS, 1 m LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7.8)) e a incubadora de chorume durante a agitação da noite para o dia. Para purificar o ADN eluído, adicionaram-se 700 µL de tampão de ligação do ADN com ChIP Zymogen no tubo de 1, 5 mL que contém a fatia de gel retalhada e o EB de Gel, misturado com pipetagem e a choradeira transferida para uma coluna de Zimominielute. As amostras foram primeiro fiadas a 1000 × g durante 3 minutos, depois 10 000×g durante 30 segundos. O fluxo foi removido e as amostras lavadas com 200 µl de Anilha Zymo (com EtOH). Os restos de Gel foram removidos por cintilação e Colunas lavadas por adição de mais 200 µL de lavabos Zymo (com EtOH). O fluxo foi removido, as colunas secadas por centrifugação a 14.000 × g durante 1 min e o ADN eluído por adição de 20 µL de TET pré-aquecido (Tris-HCl 10 mM (pH 8.0), EDTA 0,1 mM, 0,05% Tween 20). As bibliotecas foram sequenciadas.

as células Western blotting

foram lisadas com tampão de lise Igepal (50 mM Tris pH 8, 0, 150 mM NaCl, 0.5% de Igepal) e as concentrações de proteínas foram determinadas com reagente de ensaio de proteína BioRad utilizando BSA como padrão. As proteínas foram separadas em NuPage 4-12% de géis gradientes Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para uma membrana nitrocelulose (Amersham). As membranas foram bloqueadas na TBS com 0, 1% Tween-20 e 5% BSA. As membranas foram misturadas com o primário indicado durante a noite a 4 °C. foram detectados anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre utilizando o sistema de detecção da coagulação do ECL e o sistema de detecção da coagulação Ocidental (Amersham).

os animais e a cultura celular

TGEMs foram colhidos 3 dias após a injecção em ratos machos de 8 semanas C57Bl/6J, ou BALB/cJ, e revestidos a 20 × 106 células por placa de Petri de 15 cm em DMEM mais 10% FBS e 1× penicilina-estreptomicina. Um dia após o revestimento, as células foram suplementadas com meios frescos e tratadas com PBS (Veh) ou 100 ng/mL de UCK durante 1 h, sendo depois utilizadas directamente para análises a jusante. o iBMDM é produzido por infecção da BMDM com um retrovírus contendo myc e Braf V600E66. As células imortalizadas são então cultivadas ao longo de várias semanas. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os padrões éticos estabelecidos pela Universidade da Califórnia, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (IUCAC).a produção de lentivírus foi modificada para conter um andaime U6-bsmbi-spgRNA e um promotor CMV a conduzir o tagBFP2. 2 CRISPR guias foram inseridos para cada destino através de amplificação por PCR com o H1 promotor (bsmbi site/guide1/andaime/H1 promotor/2/bsmb1 site) para um total de 2 guias por vírus (U6 e H1 dirigida) (Quadro Suplementar 4). O vírus foi produzido com o sistema pVSVg / ppAX2. Dois dias após a transfection, a mídia foi coletado e centrifugado a 4 °C por 2 h a 20.000 x g. Pellet de células foi reconstituído durante a noite a 4 °C em OPTI-MEM e armazenado a -80 °C.

a Produção de CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs foram produzidas usando de lentivirus de infecção. o iBMDM-CAS9-IRES-EGFP foi infectado com MOI 100, medido em células 293T, com Lentiblast (biosciências OZ) (5 µL cada reagente) em OPTI-MEM. Este foi então centrifugado a 1300g por 1 h à temperatura ambiente. O meio foi então removido e as células foram suplementadas em meio de medula óssea (30% de células L, 20% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina no DMEM) durante 2 dias. As células foram então classificadas por infecção pela expressão de um transgeno na sequência viral (tagBFP2).o resumo dos relatórios da investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção experimental.

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