DNA de tripla hélice de formação: Uma ferramenta potencial genético para reparar

*Autor Correspondente: D. V. Kohli
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Índia
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Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Oligonucleótidos triplos que formam a hélice tripla, que se ligam ao DNA de cadeia dupla, são de especial interesse, uma vez que são direcionados para o próprio gene e não para o seu produto mRNA (como na estratégia anti-senso). No entanto, a fraca estabilidade de algumas destas estruturas pode limitar o seu uso em condições fisiológicas. Ligandos específicos podem intercalar em hélices triplas de DNA e estabilizá-los. Esta revisão resume os recentes avanços neste campo, ao mesmo tempo que destaca os principais obstáculos que ainda não foram superados, antes que a aplicação da tecnologia triplex à reparação de genes terapêuticos possa ser alcançada.formação de hélice tripla (Fig. 1) recentemente tem sido o foco de grande interesse devido à possível aplicação no desenvolvimento de novas ferramentas de biologia molecular, bem como agentes terapêuticos e devido à possível relevância das estruturas de ADN-H em sistemas biológicos . Em estruturas intermoleculares, uma sequência de oligopirimidina-oligopurina do DNA duplex é ligada por um oligonucleótido de terceira cadeia no sulco principal .

Dois tipos principais de triplas hélices têm sido descritos, dependendo da orientação da terceira vertente . Os primeiros complexos de Tripla hélice relatados envolveram a terceira cadeia pirimídica cuja ligação se baseia em ligações de hidrogênio Hoogsteen entre um par de base T-A e timina, e entre um par de base C-G e citosina protonada . O oligonucleótido (T, C) que contém oligonucleótido liga-se paralelamente à cadeia da oligopurina no chamado motivo da pirimidina. Uma segunda categoria de hélices triplas contém purinas na terceira cadeia, que é orientada antiparalel à cadeia oligopurina. C·G×G E T * A×a trigêmeos de base são formados após um esquema de ligação de hidrogênio Hoogsteen reverso . Oligonucleótidos contendo T E G também podem formar hélices triplas cuja orientação depende da sequência de base .a formação de hélice tripla oferece um meio direto de manipulação seletiva da expressão genética em células, onde as hélices triplas de DNA oferecem novas perspectivas para a regulação de genes direcionados a oligonucleótidos (Fig. 2). Oligonucleótidos sintéticos que formam a tripla hélice ligam – se com elevada afinidade e especificidade à cadeia purina na maior ranhura da sequência homopurina-homopirimidina em ADN de cadeia dupla .

TFOs é um bom candidato para ser utilizado como agentes de ligação do ADN específicos do local e está a ser investigado para o seu uso como potenciais agentes terapêuticos. Eles foram estudados em aplicações anti-senso, onde eles são projetados para atingir o mRNAs, aplicações de antigene, onde eles controlam a expressão genética através da formação de Tripla hélice, e em aplicações que visam proteínas, onde eles são usados como aptamers .

TFOs também pode ser usado em terapia genética onde eles visam a sequência de DNA de gene mutado para evitar a sua transcrição. Os tractos ricos em purinas são frequentemente encontrados em regiões promotoras de genes e os TFOs direccionados para estes locais regulatórios têm demonstrado reduzir selectivamente a transcrição dos genes visados, provavelmente bloqueando a ligação dos activadores transcritionais e/ou a formação de complexos iniciadores. A modulação da transcrição mediada por Triplex tem potencial aplicação na terapia, uma vez que pode ser usada; por exemplo, para reduzir os níveis de proteínas consideradas importantes nos processos de doença. Os TFOs também podem ser usados como ferramentas moleculares para o estudo da expressão genética e têm sido provados ser eficazes em várias estratégias de direcionamento de genes em células vivas. Os TFOs podem ligar-se às regiões da polipurina/polipirimidina no ADN de uma forma específica de sequência. A especificidade desta ligação levanta a possibilidade de utilizar a formação triplex para modificação do genoma dirigida, com o objectivo final de reparar defeitos genéticos nas células humanas. Vários estudos demonstraram que o tratamento de células de mamíferos com TFOs pode provocar a reparação e recombinação do ADN, de uma forma que pode ser explorada para introduzir mudanças de sequência desejadas. Foram relatados vários estudos em que oligonucleotídeos foram utilizados como compostos antigénicos dentro das células .

a formação de Tripla hélice de DNA é um resultado da ligação de oligoinucleótidos com uma elevada especificidade de reconhecimento à maior Fenda do DNA duplo hélice, formando ligações do tipo Hoogsteen com bases purinas dos pares de base Watson-Crick, o composto racionalmente projetado para regulação artificial da expressão genética . A formação Triplex requer Mg2+ ions, enquanto que é inibida por K+ ions.

na estratégia de Tripla hélice ou antigeno, o oligonucleótido liga-se no sulco principal do ADN de cadeia dupla via ligação de hidrogénio Hoogsteen para formar uma hélice tripla . Os TFOs ligam-se às sequências homopurina-homopirimidina em ADN de cadeia dupla. Há quatro motivos estruturais para a formação triplex que foram descritos com base na composição da terceira linha e sua orientação em relação à linha rica em purinas do duplex. Purine motif TFOs (those that are comprised of G and a) form G*G:C and a*A:T triplets and bind in antiparallel orientation with regard to the purine strand of the duplex. Por outro lado, pirimidina motivo TFOs (C/T) de forma triplexes em paralelo orientação e, geralmente, apenas no baixo pH devido à necessidade de as bases citosina sendo protonated, a fim de formar Hoogsteen obrigações; eles formam C+*G:C e T*A:T trigêmeos. Finalmente, os tfos mistos purina e pirimidina ligam-se em orientação paralela ou antiparalela e formam G*G:C E T*A:T trigémeos. A orientação em que o motivo misto TFOs se liga, é dependente do número de passos GpA e ApG no trato homopurino . A orientação antiparalél é favorecida por um maior número de passos, enquanto um baixo número de passos favorecem a orientação paralela .

Uma vez estabelecido o melhor motivo para a ligação de uma determinada sequência-alvo, os problemas com oligonucleótidos fosfodiester naturais limitam o sucesso da abordagem antigénica e as aplicações terapêuticas dos oligonucleótidos em geral. Oligonucleótidos com a coluna vertebral do fosfodiester natural são suscetíveis a endo e exonucleases. A atividade predominante que degrada oligonucleótidos é a atividade 3′-exonuclease, mas a atividade endonuclease também foi observada em algumas configurações . Assim, para a aplicação como terapêutica in vivo, o TFOs deve ser capaz de resistir tanto à atividade de exonuclease quanto à endonuclease, a fim de atingir o seu alvo. Uma modificação da coluna vertebral que confere resistência à nuclease, mas permite a ligação a DNA de cadeia dupla com alta afinidade é necessária para as aplicações in vivo de TFOs.

os oligómeros morfolino Fosforodiamidato são oligonucleótidos da coluna vertebral modificados que foram previamente investigados como agentes antissensivos . Os oligonucleótidos morfolinos têm uma espinha dorsal sem carga na qual o açúcar deoxirribose do DNA é substituído por um anel de seis membros e a ligação fosfodiéster é substituída por uma ligação fosforodiamidato (Fig. 3). Os oligonucleótidos morfolinos são resistentes à degradação enzimática e parecem funcionar como agentes antissensivos, prendendo a tradução ou interferindo com o splicing pré-ARNm, em vez de activando a RNase H. Eles têm sido entregue para células de cultura de tecidos através de métodos que fisicamente interromper a membrana da célula, e um estudo comparando vários métodos descobriu que raspar o carregamento foi o método mais eficiente de entrega; no entanto, devido a morpholino espinha dorsal é vazia, lipídios catiônicos não são eficazes mediadores de morpholino oligonucleotide absorção nas células . Um relatório recente demonstrou a formação triplex por um oligonucleótido morfolino e, devido à espinha dorsal não-iónica, estes estudos mostraram que o oligonucleótido morfolino era capaz de formação triplex na ausência de magnésio .

Catiões desempenham um papel importante na triple helix formação. Quando os oligonucleótidos fosfodiester são usados como TFOs, o magnésio é geralmente necessário para a formação triplex com purina e motivos mistos TFOs; ele também acelera a reação e estabiliza o triplex formado com pirimidina motif TFOs . Demonstrou-se que outras catiões divalentes funcionam na mesma capacidade que o magnésio no que respeita à formação triplex . O magnésio ocorre numa concentração de ~0, 8 mM na célula e ~1 , 5 mM no sangue, mas a maioria das reacções triplex in vitro é realizada em 5-10 mM MgCl2. O potássio ocorre na célula a uma concentração de ~ 140 mM, e a 4 mM no sangue. Concentrações elevadas de potássio podem inibir a formação triplexa com oligonucleótidos ricos em guanina, concebidos como TFOs, favorecendo outras estruturas secundárias de ADN, tais como dímeros e quadruplexos . Será necessário superar a capacidade limitada de Fosfodiester TFOs para formar um triplex em magnésio baixo e potássio elevado para que eles sejam eficazes em condições fisiológicas. Num estudo recente de morfolino TFOs, a formação triplex foi demonstrada na ausência de magnésio e na presença de potássio. Estas propriedades fazem de morpholino TFOs bons candidatos para mais estudos como antigene therapeutics.

Modelagem Molecular

Estrutura triplex de DNA pode ser construída por técnicas de modelagem molecular usando coordenadas que corretamente levam em conta a conformação de açúcar de hélices triplas (T,C)-motivos . Esta estrutura está mais próxima de um DNA de forma B , como relatado por estudos NMR em comparação com a estrutura proposta, com base na difração de raios X de fibra. O programa JUMNA permite a construção de estruturas de DNA de acordo com seus parâmetros helicoidais . Um local de intercalação pode ser facilmente criado no triplex, dobrando o parâmetro de elevação para dois trigêmeos adjacentes de Base T·A×T (rise = 6.8 Å), e subsequentemente diminuindo o parâmetro de torção entre estes dois trigêmeos de 34° para 16° para reduzir as restrições de distância de ligação.usando modelagem molecular, pode-se demonstrar a possibilidade de formar uma hélice tripla paralela na qual a única cadeia interage com o duplex intacto na ranhura menor, através de novas interações de base .JUMNA usa uma mistura de coordenadas helicoidais e internas (ângulos de Valência e diédricos) para descrever a flexibilidade dos ácidos nucleicos. Os parâmetros helicoidais posicionam cada nucleótido de 3’monofosfato em relação a um sistema de eixo fixo. As junções entre nucleótidos sucessivos são mantidas com restrições quadráticas nas distâncias O5 ‘- C5’. Além de um número reduzido de variáveis com relação aos programas de coordenadas cartesianas, a escolha de variáveis fisicamente significativas permite grandes movimentos conformacionais concertados durante a minimização, juntamente com um controle eficiente da estrutura e fácil introdução de restrições ou restrições. As ferramentas disponíveis incluem mapeamento adiabático e pesquisas combinatórias em relação aos parâmetros estruturais escolhidos. Particularidades do Flex campo de força incluem a presença de um termo específico para a conta para a dependência angular da ligação de hidrogênio e a possibilidade de a energia eletrostática de triagem com um sigmoidal função dielétrica , ε (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), onde R é a distância entre duas cargas. O declive S, o valor do patamar a longa distância D, e o valor inicial D0 da função são ajustáveis, com valores padrão de 0,16,80 e 1,respectivamente, usando dois pressupostos já utilizados para a construção da hélice tripla menor-sulcos . Primeiro, as trigêmeas de base são restringidas para serem coplanares para evitar qualquer possível InterBase interplet interplet inter. Tais interações facilmente se formam durante a construção de hélices esticadas, mas não podem desempenhar um papel no reconhecimento ou troca de strand, uma vez que estes processos são independentes da sequência geral. Verificou-se que a estrutura optimizada do triplex minor-groove é independente destas restrições. A segunda suposição, em linha com a estequiometria de complexos de RecA/ DNA, que mostra três nucleótidos por monômero RecA, é o uso de simetria helical de trinucleótido. Por esta razão, os estudos preliminares têm sido limitados a sequências com repetição de trinucleótidos.são necessárias restrições ou restrições específicas para a construção e manipulação do triplex. Estes incluem as restrições de “plateau” e as restrições de simetria de trinucleótido, descritas anteriormente . A contenção do “plateau” mantém a co-planaridade das bases formando um tripleto, permitindo as rotações e deslocamentos necessários para a troca de pares de base. A restrição de simetria trinucleótida implica a equivalência das variáveis que descrevem cada grupo sucessivo de três nucleótidos. Esticar dsDNA, de modo que a torção diminui e o sulco menor abre foram previamente alcançados, restringindo a distância entre os átomos terminais de O3′ da unidade de simetria trinucleótida. Este sistema de retenção foi ligeiramente modificado porque a distância O3′-O3′ pode ser alterada por uma deslocação lateral das espinhas dorsais durante a troca da cadeia. Em um trabalho recente, apenas o componente do vetor O3′-O3′ paralelo ao eixo da hélice foi contido. As restrições na largura do sulco, calibradas com a ajuda de cálculos eletrostáticos numéricos de Poisson-Boltzmann, foram usadas para evitar estreitamento do sulco devido à falta de moléculas explícitas de solvente .

a mudança de par de Base é estudada pela rotação de base, usando a abordagem definida por Bernet et al . Trata-se de um sistema de retenção aplicado ao ângulo θ entre a ligação glicosídica (purina: C1′-N9 ou pirimidina: C1′ – N1) e o vector que une os dois átomos C1′ de um par de base, projectado no plano perpendicular a um eixo helicoidal local. θ tem um valor de 55° no ADN-B canónico. A troca de pares de bases de modelagem para uma base escolhida envolve uma variação adiabática de θ de 65° para 10° por etapas de 2°, mantendo tanto o” planalto ” quanto as restrições de alongamento.os obstáculos e limitações encontrados na formação tripla hélice são comprometidos por considerações biofísicas fundamentais, bem como por limitações impostas por condições fisiológicas. A formação Triplex envolve a aproximação e a ligação de um terceiro fio carregado negativamente a um duplex com carga dupla-negativa. A neutralização da repulsão de carga é tipicamente fornecida experimentalmente por níveis de Mg++ (5-10 mM) que são muito superiores ao que se pensa estar disponível nas células . Além disso, a formação triplex envolve mudanças conformacionais na parte da terceira linha, e alguma distorção do duplex subjacente . Os triplexos pirimidina são instáveis a pH fisiológico devido à necessidade de protonação citosina que ocorre a pH relativamente ácido (pKa = 4.5). Isto é necessário para a segunda ligação Hoogsteen hidrogênio, embora a carga positiva resultante aparentemente faz a contribuição mais importante para a estabilidade triplex . Os triplexos pirimidina contendo citosinas adjacentes são frequentemente menos estáveis do que aqueles com citosinas isoladas. Tradicionalmente, isto tem sido atribuído a efeitos de repulsão de carga, embora um estudo recente sugira que a protonação incompleta de citosina adjacentes pode ser o fator crítico . Além disso, o motivo Purino de terceira cadeia (que são ricos em G) pode formar g tetrads em níveis fisiológicos de K+, que inibem a formação triplex . Todos estes fatores impõem barreiras cinéticas na formação triplex e reduzem a estabilidade dos triplexs uma vez formados (a maioria dos triplexs, mesmo em condições ótimas in vitro, são menos estáveis do que o duplex subjacente .o principal problema encontrado na estratégia antigénica tripla-helicoidal é a instabilidade do triplex formado pelo TFOs em condições fisiológicas, o que consequentemente limita a utilização desta estratégia fascinante para a correcção genética em extensão variável. Assim, várias abordagens e estratégias têm sido propostas para conferir estabilidade à estrutura de três celas formadas.

oligonucleótido dirigido hélices triplas pode ser estabilizado usando ligantes de ácido nucleico que estabilizam seletivamente hélices triplas. Por exemplo, o brometo de etídio mostrou ligar e estabilizar uma hélice tripla feita de poli (dT)·poli (dA)× Poli (DT), que contém apenas trigêmeos T·A×T. No entanto, este composto estabiliza mal (ou mesmo desestabiliza) as hélices triplas contendo T·A×T E C·G×C+ trigêmeos de base, provavelmente como resultado de repulsão eletrostática . Derivados de benzopiridoindol foram as primeiras moléculas relatadas para estabilizar fortemente este último tipo de hélices triplas, mesmo que tenham uma preferência por trechos T·A×T. Vários outros intercaladores, bem como vários ligandos de DNA menor também têm sido mostrados para se ligar a hélices triplas de DNA. Por exemplo, hélices triplas podem ser estabilizadas por modificação química de oligonucleótidos, como, psoraleno ligado a oligonucleótidos tem sido mostrado para melhorar a sua atividade biológica após irradiação UV . Os intercaladores normalmente estabilizam em maior medida as hélices triplas contendo trigêmeos T * A×T, enquanto os ligantes de sulcos menores geralmente desestabilizam triplexos, exceto em um caso particular onde a tripla hélice envolvia uma cadeia de RNA . Como não existem dados estruturais disponíveis sobre complexos triplos de ligando-hélice tripla, não se sabe muito sobre as interações que direcionam intercalação específica para hélices triplas. Os derivados de BPI têm sido mostrados como intercalados entre trigêmeos de base T·A×T por transferência de energia fluorescente de excitação de trigêmeos de base para ligantes e por dicroismo linear e circular . Os oligonucleotídeos pirimidina-paralelos morfolino foram encontrados para ser capaz de formar um triplex com alvo duplex. Como esperado, este motivo exigiu um baixo pH para a formação triplex, como exigido pelo motivo paralelo pirimidina-fosfodiester TFO. Pode ser possível superar esta dependência de pH com tais substituições como 5-metilcitosina para as citosina na TFO .

Uma abordagem alternativa pela qual hélices triplas podem ser estabilizadas é através de modificações químicas de oligonucleótidos, tais como a ligação covalente de uma molécula de acridina . Foi demonstrado que a substituição da acridina aumenta fortemente a inibição da clivagem enzimática da restrição e também não prejudica a especificidade de sequência para a formação de triplex .a formação de hélices triplas de ADN intermolecular oferece a possibilidade de conceber compostos com propriedades extensivas de reconhecimento de sequências, que podem ser úteis como agentes antigénicos ou ferramentas em biologia molecular . Durante a última década, uma nova abordagem usando análogos de DNA, como agentes terapêuticos, está emergindo em Química medicinal. Isto é baseado na regulação da expressão de genes de proteínas/enzimas relacionadas com a doença, bloqueando a sua transcrição (antigeno) ou tradução (antisense) (Fig. 4). É afetada através da ligação específica de sequência de oligonucleótidos complementares a qualquer um do DNA duplex através da formação triplex para inibir a produção de mRNA ou interferir na tradução deste último para proteínas. Uma vez que os oligonucleótidos não entram facilmente nas células e são passíveis de destruição por nucleases celulares, uma variedade de análogos quimicamente modificados de oligonucleótidos estão sendo projetados, sintetizados e avaliados para o desenvolvimento como agentes terapêuticos.

O reconhecimento específico de homopurine-homo pirimidina regiões duplex de DNA por triplex de formação de oligonucleotídeos (TFOs) fornece uma estratégia atraente para a manipulação genética, com o objetivo de reparar defeitos genéticos nas células humanas. A capacidade de atingir mutações pode revelar-se útil, como uma ferramenta para o estudo da reparação do ADN, e como uma técnica de terapia genética e engenharia genética .ferramentas eficientes baseadas em hélices triplas foram desenvolvidas para várias aplicações bioquímicas, tais como o desenvolvimento de nucleases artificiais altamente específicas. A estratégia antigénica continua a ser um dos campos mais fascinantes da aplicação triplex para controlar selectivamente a expressão genética (Tabela 1). A focalização de sequências genómicas provou ser um conceito valioso num número ainda limitado de estudos; a mutagénese local é, a este respeito, uma aplicação interessante de oligonucleótidos triplexos, em culturas celulares .

Table 1: Os estudos do ácido nucleico antigénico no âmbito das estratégias Antigénicas80

concentram-se principalmente nos genes direccionados por recombinação homóloga ou por oligodeoxinucleótidos triplos formadores de hélice . Por muitas razões técnicas, incluindo a acessibilidade genética muito limitada dentro da estrutura cromossómica altamente malariacondensada, envolvida em proteínas, a aplicação clínica destes métodos não progrediu rapidamente. Kielkopf et al descreveram recentemente uma abordagem alternativa, usando poliamidas que podem se difundir no núcleo e reconhecer sequências específicas de DNA . Embora muito emocionante, esta metodologia ainda está em sua infância e sua utilidade clínica final permanece desconhecida .aplicações terapêuticas de tecnologia antigénica o ADN da hélice tripla atraiu a atenção devido à potencial aplicação de TFOs como agentes terapêuticos, para aplicações como o enfoque de genes intracelulares, como soluções químicas racionais para o reconhecimento sequencial específico de um duplex de ADN e identificação de genes responsáveis pelo crescimento celular e pela transformação maligna . Com este conhecimento veio um desejo natural de traduzir essa informação em novas estratégias terapêuticas específicas para o tratamento do câncer, doenças cardiovasculares e outras doenças comuns da humanidade (Tabela 2). O recente desenvolvimento de um inibidor bioquímico relativamente específico da proteína bcr/abl tirosina cinase em doentes com leucemia mielóide crónica é um exemplo impressionante desta busca . Para terapias que visam diretamente a substituição, reparação ou desativação de genes causadores de doenças, o progresso tem sido muito mais lento e um sucesso equivalente ao inibidor bioquímico bcr/abl ainda não foi alcançado. As razões para isso são complexas e variam com o tipo de terapia direcionada ao gene que está sendo usado .

Tabela 2: Algumas Doenças Passíveis de Tratamento por DNA Terapêutica

Stephenson e Zamecnik mostrou que um curto (13nt) DNA oligonucleotide inversa complementares em sequência (antisense) para o Rous sarcoma de vírus, pode inibir a replicação viral em cultura. Uma das propriedades mais importantes dos oligonucleótidos antissense e antigeno em seu uso como terapêutica é sua resistência nuclease. Os oligonucleótidos fosforotioatos são o tipo mais comum de oligonucleótidos com resistência nuclease relativamente elevada e foram introduzidos no mercado como medicamentos contra a retinite induzida por citomegalovírus . Oligonucleótidos com um resíduo de ácido nucleico 2′-O,4′ – C-etileno (ENA) na segunda posição a partir da extremidade 3′ mostram resistência nuclease muito mais elevada do que aqueles com um resíduo de ácido nucleico bloqueado (LNA) na mesma posição .

embora Kurreck et al tenham relatado que os oligonucleótidos LNA eram estáveis no soro humano, os oligonucleótidos ENA parcialmente modificados eram muito mais resistentes à nuclease do que os oligonucleótidos LNA no plasma de ratos. Além disso, os oligonucleótidos modificados contiguamente com resíduos de ona na extremidade 3′ e 5′ mostram mais estabilidade do que os parcialmente modificados. Assim, os oligonucleótidos ENA têm alto potencial como agentes antissensos e antígenos que podem ser usados in vivo . A formação triplex específica em sequência pode ser aplicada a alvos genéticos, silenciamento genético e mutagénese .

perspectivas futuras

oligonucleótidos podem ligar o local-especificamente a um gene alvo de interesse pela formação tripla hélice. Oligonucleótidos triplexos atualmente são projetados para se ligar ao gene HER-2 (receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano)/ neu, um gene que é sobre-expresso em uma grande variedade de tumores humanos, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer de ovário e tumores GI. Esta estratégia será amplamente aplicável para prevenir a expressão de muitos oncogenes ou outros genes relacionados com o cancro. Estes oligonucleótidos “antigénicos” estão agora a ser utilizados para fornecer agentes de alquilação do ADN a bases específicas do promotor HER-2/neu e sequência de codificação, para evitar a iniciação e o alongamento da transcrição. Em particular, oligonucleótidos triplexos têm sido usados para entregar mostarda nitrogenada, como o clorambucil, a uma base específica de guanina no gene HER-2/neu para prevenir a expressão do gene. A estratégia específica de luta contra o cancro que envolve oligonucleótidos antigénios associados a fármacos activos no ADN irá revelar-se um marco num futuro próximo.Thuong, N. T. and Helene, C., Angew. Chem. T., 1993, 32, 666

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