Duplo bloqueio do CD47 e HER2 elimina radioresistant células de câncer de mama

Célula linhas

de câncer de mama Humano MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 linhas de células, glioblastoma U251, e o câncer de cólon HCT116 linhas celulares foram comprados da ATCC. As células MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549 e U251 foram mantidas em meio DMEM complementadas com 10% de FBS, e as células SKBR3 mantidas em meio RPMI-1640 com 10% de FBS. As células HCT116 foram mantidas no meio 5a de McCoy com 10% de FBS. As linhas celulares MCF7/C6 e MDA-MB-231/C5 que foram clonadas a partir das fracções sobreviventes das células MCF7 e MDA-MB-231 após irradiação repetida; as células estaminais do cancro da mama com sobre-expressão HER2 (HER2+/CD44+/CD24−/baixo BCSCs) foram isoladas a partir do MCF7/C626. As células 4T1 do cancro da mama triplo-negativo do rato foram mantidas em meio DMEM com 10% de FBS. O THP-1 monócito humano foi cultivado em meio RPMI-1640 formulado em ATCC, complementado com 10% de FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g / L de glicose e 2-mercaptoetanol a uma concentração final de 0,05 mM. Mouse Mφ RAW 264.7 células foram cultivadas em meio DMEM com 10% de FBS seguindo o método de cultura ATCC. Todas as linhas celulares foram testadas com contaminação mycoplasma negativa com Kit de ensaio MycoSensor PCR (Agilent Technologies, Catalog # 302108).plasmídeos e reagentes

cd47 vector luciferase controlado pelo promotor foi construído através da clonagem da região promotora do CD47 humano (-1554 nt) para o plasmídeo pgl2-plasmídeo básico de sítios KpnI/Hind III. A eliminação dos sites de ligação putativos NF-kB (TGGAAGCT-764-757) foi realizada usando um kit de mutação rápida (Stratagene, La Jolla, CA). As sequências de iniciação utilizadas: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (catálogo # S1028) foi comprado de Selleckchem. Anticorpo anti-CD47 (B6H12) para IHC, ICC, e western blot foi comprado de Santa Cruz (catálogo # sc-12730). Anti-CD47-FITC for flow cytometry was purchased from BD Biosciences (Catalog # 556045). O anticorpo anti-humano CD47 (B6H12) para o teste de fagocitose foi extraído de b6h12.2 hybridoma (ATCC® HB-9771™). O anticorpo CD47 anti-rato para inibição tumoral in vivo foi extraído do hibridoma MIAP301 fornecido pelo Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). Anticorpo anti-CD11b para coloração IHC foi comprado de Invitrogen (catálogo # MA5-17857). O anticorpo monoclonal anti-α-tubulina do rato para o western blot foi comprado de Sigma-Aldrich (Catalog # T6074). O anticorpo monoclonal anti-β-actina do rato para o western blot foi comprado de Sigma-Aldrich (Catalog # A5441). Anti-HER2/ERBB2 (Catalog # 29D8) anticorpo para a coloração IHC e western blot foi comprado da Cell Signaling Technology (Catalog # 2165). Anticorpo anti-HER2-APC para análise de citometria de fluxo foi comprado a partir de Biociências BD (Catalog # 340554).as proteínas de células ou tecidos tumorais foram extraídas no tampão de lise do RIPA (Pierce), complementado com cocktail de inibidores da protease e fosfatase (Sinalização Celular). A concentração de proteínas foi determinada utilizando o ensaio BCA (Pierce). Os lisatos foram então desnaturados e as amostras contendo 30 µg de proteínas foram submetidas a electroforese em gel de 10% de SDS-poli-acrilamida, seguido de transferência para membranas de Difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad). Após bloqueio com 5% de leite seco sem gordura, a membrana foi exposta ao anticorpo primário e incubada a 4 °C durante a noite. Blots foram visualizados através da rotulagem com anticorpos secundários acoplados a HRP (Sigma-Aldrich) e incubação com reagente de detecção de blotting western Amersham ECL (Catalog # RPN2106). Blots foram desenvolvidos em um desenvolvedor Konica SRX101A e quantificados com o ImageJ.as células recolhidas foram enxaguadas com PBS contendo 0, 5% de BSA em PBS e as células em pellets foram incubadas com anticorpos primários marcados por fluorescência a 37 °C durante 30 minutos, seguido de lavagem três vezes com 0, 5% de BSA/PBS. Todos os anticorpos foram titulados para otimizar a condição antes de se aplicar ao experimento. A análise da citometria de fluxo foi realizada usando o citômetro do FACS Canto II (BD) e a análise subsequente foi realizada usando o software FlowJo (Tree Star, Ashland, ou, EUA). As estratégias de gating foram baseadas em Propriedades FSC e SSC e foram configuradas para populações de células positivas em FITC, canais APC.

de câncer de mama Humano tecidos

Fresco congelado HER2 positivo e negativo de câncer de mama tecidos foram fornecidos pela UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665, e o IRB # 218204), financiado pela UC Davis Comprehensive Cancer Center Subsídio de Apoio (CCSG) concedida pelo Instituto Nacional do Câncer (NCI P30CA093373) com todas as informações do paciente bloqueados, exceto os resultados do diagnóstico. Foram obtidas amostras patológicas adicionais de cancro da mama humano, incluindo as secções Não encadeadas de 4 µm de parafina fixa com formalina (FFPE) emparelhadas com cancro da mama primário e cancros da mama recorrentes, provenientes do Departamento de patologia, Universidade do Estado de Ohio, com aprovação do IRB (#2002H0089).a imunohistoquímica (IHC)

a coloração imunohistoquímica foi feita em secções de tecido FFPE de 4 µm de espessura. Resumidamente, as lâminas foram desparafinizadas e rehidratadas, e os antigénios foram recuperados durante 40 minutos num tampão citrato (pH 6.1) a 95 °C. A actividade endógena da peroxidase foi bloqueada com uma solução H2O2 de 3%. A incubação primária de anticorpos foi efectuada a 4 °C durante a noite, seguida do Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) na TR durante 30 minutos, de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos da reacção foram detectados utilizando o Kit de substrato da Peroxidase e contrastados com hematoxilina (laboratórios vetoriais). Dois patologistas seniores estavam encarregados do diagnóstico de cancros da mama clínica e da avaliação de tumores experimentais. A expressão CD47 foi avaliada usando intensidade de coloração e porcentagem de células manchadas. A intensidade da coloração foi classificada como 0: negativo; 1: fraco; 2: moderado; 3: forte. Alta expressão foi definida como forte intensidade de coloração em mais de 25% das células tumorais; a expressão média foi intensidade de coloração moderada em mais de 25% das células tumorais.; baixa expressão era fraca coloração de intensidade em mais de 25% de células tumorais ou moderada coloração em <25% de células tumorais utilizando o ASCO-CAP guidelines63 foi utilizado para a interpretação de HER2 imunohistoquímica (IHC), e a expressão da proteína HER2 foi classificado como negativo IHC 0 (nenhuma mancha ou coloração de membrana que é incompleta e desfalecido está o/quase imperceptível e dentro ≤10% da invasivo de células tumorais) ou negativo IHC 1+ (incompleta membrana de coloração que é fraco/quase imperceptível e dentro de >10% do invasiva de células tumorais); equívocos IHC 2+ (circunferencial de membrana de coloração que está incompleta e/ou fraco/moderado e dentro de >10% do invasiva de células tumorais; e ou completos, e circunferencial de membrana de coloração que é intenso e dentro ≤10% da invasivo de células de tumor); Positivo IHC 3+ (circunferencial de membrana de coloração que é completa, intensa em mais de 10% da invasivo de células tumorais). Se os resultados foram equívocos (2+), testes de reflexo foram realizados usando hibridização in situ (ISH). Ao detetar a expressão CD47 de tumores irradiados in vivo, os tumores de ratinho tratados foram removidos e fixados em 4% de paraformaldeído em PBS durante 24 h. Os espécimes foram desidratados com etanol em série (70%, 95% e 100%) durante 48 horas antes incorporados na solução de parafina (Polissicências).

Imunocitoquímica (ICC)

as Células foram semeadas em rodada de lamelas e cresceu para 60% a 80% de confluência, seguido de lavagem com PBS, fixação em 4% paraformaldeído (pH 7,2), e permeabilization com 0,1% de Triton X-100 em PBS. As células foram então incubadas numa solução de bloqueio durante 15 minutos antes da incubação com o anticorpo primário durante a noite, a 4 °C, com diluições de 1:250. As células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com TR ou FITC diluídos 1:1000 na solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente no escuro e analisados com microscopia confocal.

A identificação de proteínas antigénicas associadas à radiação

C57/B6 ratinho foi usado como um hospedeiro de imunização com 5 × 106 células MCF7 / C6 em 0.1 ml de volume injectado na base da cauda ou do pé por rato, seguido de reforço com o mesmo volume de células ao 14.o dia. No quinto-sétimo dia após o segundo desafio, os ratos foram eutanasiados e o soro foi coletado para detectar moléculas antigênicas expressas em células BC radiresistentes. A fim de distinguir as farpas de moléculas não específicas expressas em células epiteliais mamárias normais e células MCF7 de tipo selvagem, foi realizado um procedimento pré-limpo com o soro bruto pelas seguintes etapas. Dois milhões de células epiteliais MCF10A epiteliais mamárias normais humanas foram preparadas numa solução contendo 1 mm EDTA / PBS sem tripsina para evitar a digestão de algumas das proteínas sensíveis, seguida de lavagem com PBS duas vezes. As células foram peletizadas e, em seguida, solte tocando a parte inferior do tubo, seguido pela adição de 1 ml de rato anti-soros e girar a 4 °C por 2 h. A mistura foi então centrifugada a 9391 × g por 5 min a 4 °C e o sobrenadante foram coletadas, o que foi repetido uma vez. O primeiro anti-soro limpo foi ainda mais limpo por incubação com células MCF7 de tipo selvagem usando os mesmos procedimentos e repetido seis vezes. O anti-soro final purificado foi então testado pela western blot contra lisato de proteína de células MCF10A, células MCF7, MCF7/C6, e células RD-BCSC que foram classificadas pelos marcadores HER2+/CD44+/ CD24− bem como aldeído desidrogenase (ALDH)64. CD47 e HER2 em conjunto com outros RAAPs no radioresistant BC foram identificadas células por western blots ou por imunoprecipitação de proteínas de membrana, purificada a partir de RD-BCSC células e as frações eluídas foram analisados através de LC/MS. O resultado da membrana RAAPs foram agrupadas com um número de proteínas e as proteínas categorias funcionais.

CRISPR edição de HER2 e CD47

O sgRNAs foram projetados seguindo as instruções publicados pelo Dr. Zhang Laboratório CRISPR design software (http://crispr.mit.edu) e o protocolo estabelecido, que tem sido descrito na anterior publication65. Quatro Oligos foram projetados correspondendo ao sgRNAs humano foram sintetizados e clonados em vetor lentiCRISPR v2 seguindo o protocolo de amplificação da Biblioteca conjunta de Zhang Lab GeCKO. Para minimizar a possibilidade de alvos não específicos, três oligos sgRNA de cada gene alvo foram sintetizados e testados. The sgRNA with the best knockout efficiency determined by western blotting was chosen for subsequent experiments. As sequências de sgRNA foram usadas para células humanas e mouse da seguinte forma:

hHer2gRNA_F: CACCGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Após incubação de 12 h, adicionou-se às células 1 ml de sobrenadante contendo vírus com 8 ng de polibreno, seguido de incubação de 6 H. em seguida, adicionou-se 0,5 ml de meio regular adicional contendo 10% de FBS inactivados pelo calor e cultivou-se de novo durante a noite. A infecção meio foi substituído com 2 ml de meio fresco com 10% FBS e cultivadas por um período de 72 h. As células foram passaged 60 mm de cultura de tecidos pratos e selecionados pela cultura em 0,3 µg/ml Puromysin por 1 semana e o knockout do gene alvo foi verificado por immunoblotting.

Luciferase composição

as Células foram transfected com pGL2-basic-CD47 ou pGL2-basic-CD47-ΔNF kB ou pGL2-NF-kB luciferase repórteres, e luciferase atividade foi medida por Luminómetro (Promega, Madison, WI). Para a normalização da eficiência da transfecção reporter, a concentração total de proteínas de lisatos foi medida com o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) com a BSA como padrão.

Cromatin immunoprecipitation (ChIP) assay

Cells were cross-linked with formaldeído (1% final) for 10 min, washed with ice-cold PBS, and collected in SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). A cromatina foi tosquiada por sonicação, pré-limpa com sapos de agarose conjugados com proteína G e incubada com anti-p65, anti-C-Rel ou IgG normal às 4 C durante a noite. Após adição de proteína G durante 2 h a 4 °C, O complexo foi lavado de forma sequencial com tampões de lavagem com baixo e alto complexo imunológico salgado (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 mais 150 mM de NaCl para sal baixo e 500 mM de NaCl para tampões de sal elevados), seguidos de tampão TE (duas vezes). A interacção factor de transcrição do ADN foi invertida após a adição de NaCl e incubação a 65 °C durante a noite. Após a digestão da RNase A e da Proteinase K, os fragmentos de ADN foram purificados por extracção de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol. As DNAs foram purificadas e utilizadas para a PCR com iniciadores específicos para a região do promotor genético, abrangendo locais de ligação NF-kB. Os primers CD47 foram:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Foram obtidos anticorpos monoclonais anti-rato CD47 IgG2a (MIAP301) e hibridoma do Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). Ambas as linhas celulares hybridoma foram mantidas em meio IMDM com 20% de FBS. Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de hibridoma utilizando resina de proteína G do GenScript (Catalog # L00209) de acordo com procedimentos padrão de fabrico. As amostras foram então mais concentradas 10-20 vezes usando dispositivos centrífugos de Microssep de Ciências da vida de Pall. As concentrações de IgG purificadas foram determinadas medindo a absorvância em OD280.o ensaio de fagocitose foi mantido numa incubadora de 5% de CO2 a 37 °C66, com uma densidade aproximada de 1 × 106/ml. Cerca de 0,8 × 106 células/ml de 264,5 células crus ou 1 × 106 células THP1 foram semeadas numa placa de 6 alvéolos. Após 24 h de incubação RAW 264.7 células foram ativadas pelo tratamento com 0,1 µg/ml de lipopolysaccharide (LPS) por 24 h. Monócitos THP1 células foram diferenciação por Phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (40 nM) por 48 h. Os macrófagos activados foram manchados com Dio na concertação final a 40 nM num meio durante 20 minutos, seguido de lavagem três vezes com meio. As células cancerígenas foram rotuladas com ddao de 1 µM (solução de reserva de 5 mM em DMSO armazenada a -20 °C) em PBS a 37 °C durante 15 minutos e lavadas com PBS contendo 1% de FBS. As células-alvo marcadas com DDAO (1 × 106) foram adicionadas aos Mφs manchados com DIO e incubadas num volume final de 2 ml a 37 °C durante 2 H. Após a incubação, os Mφs e as células-alvo foram colhidos com três vezes a lavagem EDTA-PBS seguida de uma tripsinização de 0,25%. A fagocitose foi avaliada através da avaliação das células com dupla marcação (DIO+/DDAO+), que representa as células fagocitizadas do câncer de mama por Mφs maduros, via citometria de fluxo. O software FlowJo foi usado para análise.o ensaio de sobrevivência Clonogénica foi efectuado após radiação com ou sem tratamento (Lapatinib, 10 µM para 72 h; anticorpo anti-CD47 10 µg/ml durante a noite). As células tratadas foram cultivadas durante 10-14 dias e as colónias foram fixas, manchadas com mancha azul de Coomassie. Colônias contendo mais de 50 células foram contadas como clones sobreviventes e normalizadas para a eficiência de revestimento de cada linha de células tumorais tratadas com farsa.a capacidade de enchimento da abertura foi medida com 1 × 106 células cultivadas em cada uma das placas de 6 alvéolos até 100% de confluência, seguida de inanição de 24 h. Em seguida, a abertura foi criada raspando o prato na diagonal com uma ponta de pipeta estéril. Durante a experiência, as células não foram tratadas ou tratadas com 10 µg/ml de IgG ou anticorpo anti-CD47. A capacidade de Enchimento foi monitorizada para 72 h E foram obtidas imagens representativas no dia 0 (Dia da raspagem) e no dia 3.

formação de Tumoresfera

as células foram crivadas com filtros de células de 40 µm (Catalog # 352340. As suspensões para células únicas foram semeadas em placas de Petri de 60 mm de baixa fixação, com uma densidade de 1000 células/ml. As células foram cultivadas em meio basal epitelial mamário sem soro (MEBM), complementado com B27 (Catalog # 17504-044. Life Technology), 20 ng / ml EGF (Catalog # 4022-500. Bio-vision), 20 ng / ml basic-FGF (Catalog # 13256-029. Invitrogen), and 4 µg / ml heparina (Catalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). As células foram cultivadas durante 10 dias e os tumores foram contados sob microscopia de luz.

teste de invasão Transwell

Aliquots (0. 4 ml) of Matrigel (Catalog # 356231. Biociências BD) foram diluídas em tampão de revestimento: 0, 01 M Tris (pH 8, 0), 0, 7% NaCl até à concentração final de 200-300 µg/ml. Cerca de 100 µl foram carregados na câmara superior do transwell de 24 poços (Catalog # 3422. Costar) e incubado a 37 ° C para gelificação de cerca de 1 h. Retirar cuidadosamente o restante tampão de revestimento da membrana de suporte permeável sem perturbar a camada e adicionar as células (2,5 × 104/ml). A câmara inferior foi preenchida com 800 µl de MEM media contendo 5 µg/ml de fibronectina (Catalog # SC-29011. Santo). O transwell com células tratadas de forma diferente foi incubado por 48 h e manchado com Kit de coloração Diff-Quick (Catalog # K7128). IMEB INC).

preparação de F (ab’)2 Fragmentos

CD47 F (ab’)2 fragmentos foram produzidos por clivagem de resina de papaína de IgG usando um kit de preparação F (ab’)2 (Catalog # 786272. G-Biociência) de acordo com as recomendações do fabricante e com o procedimento de comunicação 67. Após a digestão da papaína, o fragmento Fab foi separado da IgG não digerida e da região Fc com a proteína uma coluna de Spin do kit de fragmentação Fab as colunas de dessalinização GT-600 foram fornecidas para garantir que a amostra inicial de anticorpos fosse a condição ideal para a fragmentação do Fab e a IgG cd47 do Ratinho purificada foi colhida para o tratamento in vivo de tumores do Ratinho.

a Radiação do BC células com CRISPR-KO CD47 e/ou HER2

Para o teste in vivo de tumor inibição eficácia por radiação com deficiente CD47 e HER2 estado, 5 × 105 4T1/C2 células com CRISPR-nocaute da CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) ou duplo (CD47−/−/HER2−/−) foram implantados em mamária de bolsas de gordura de BALB/c (n = 6 por grupo). O crescimento do Tumor foi avaliado medindo o volume do tumor a cada 2 dias a partir do dia 7 até que o volume do tumor atingiu a limitação. Para avaliar a radiossensibilidade de tumores com diferentes status de CD47 e HER2, radiação tumoral local foi entregue com 5 Gy para cada tumor no dia 9 e o crescimento tumoral foi medido a cada dois dias até que os tumores de controle atingiram a limitação máxima.

RT do rato BC com tratamento anti-CD47 e/ou HER2

para testes in vivo de inibição tumoral com um único anticorpo CD47 na presença ou ausência de radioterapia, o tratamento anti-CD47 seguiu o protocolo por Willingham et al20 com algumas modificações. Ratos fêmeas (Charles River Laboratories, Sacramento, EUA) com oito semanas de idade, imunocompetentes (BALB/c), foram injetados com 1 × 105 células mamárias 4T1 nas 4ª glândulas mamárias. Cinquenta microlitros PBS contendo 100 µg de IgG de controlo ou fragmentos anti-CD47 F (ab’) foram injectados no local do tumor (dia 1) ou nos tecidos tumorais (dia 15) e repetidos em dias alternados até ao final das experiências. O volume do Tumor era monitorizado a cada 5 dias. Para o tratamento por radiação, anti-CD47 ou radiação combinada com anti-CD47, os animais com tumores 4T1 foram aleatoriamente divididos em vários grupos de tratamento e um grupo de controlo (5-10 ratinhos por grupo). A radiação local do Tumor começou quando o volume do tumor atinge 200 mm3 com o abr (5 Gy/dia/tumor para quatro fracções utilizando a fonte IR de micro-feixe; dose total = 20 Gy) combinado com três vezes injecções de tumor de anti-CD47 F (ab’). A radiossensibilidade dos tumores irradiados in vivo com a presença ou ausência de anti-CD47 F (ab’) foi avaliada através da medição do volume tumoral no final das experiências. Os animais foram eutanasiados quando os tumores eram ~1400 mm3 ou quando os animais pareciam ser desconfortáveis, mesmo quando o tumor era menor do que 1400 mm3 para cumprir com os regulamentos UCD IACUC para o uso de animais vertebrados em pesquisa. O protocolo de uso e cuidado animal da radioterapia in vivo foi aprovado pelo Comitê Institucional de uso e cuidado Animal da Universidade da Califórnia Davis (IACUC 15315).

para testes in vivo de inibição tumoral com anticorpos duplos para CD47 e HER2 na presença ou ausência de radioterapia, ratos fêmeas (BALB/c) com oito semanas de idade, imunocompetentes (Charles River Laboratories, Sacramento, EUA) foram injectados com 1 × 105 células mamárias 4T1 nas 4ª glândulas mamárias. Quando o volume do tumor atingiu cerca de 200 mm3, os ratos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos (6 ratos por grupo). Os fragmentos PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) (100 µg) ou Herceptin (5 mg/kg) foram injectados nos tecidos tumorais 4 h antes da radioterapia local (5 Gy por dia durante 2 dias). Foram realizadas injecções e os tamanhos dos tumores foram monitorizados em dias alternados até ao final das experiências. Os ratos foram eutanasiados quando os tumores eram ~1400 mm3 ou quando os animais pareciam ser desconfortáveis, mesmo quando o tumor era menor do que 1400 mm3 para cumprir com os regulamentos UCD IACUC para o uso de vertebrados animais em pesquisa. O protocolo de uso e cuidado animal da radioterapia in vivo foi aprovado pelo Comitê Institucional de uso e cuidado Animal da Universidade da Califórnia Davis (IACUC 15315).foram implantadas 4T1 células de tecido adiposo mamário em ratinhos BALB/c e o tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram cerca de 200 mm3 por injecção de tumor de 50 µl PBS contendo 100 µg de IgG de controlo, fragmentos anti-CD47 F (ab’), Herceptina ou ambos os anticorpos, em dias alternados, durante três vezes. A RT local tumoral foi entregue nos dias 10 e 11 com 5 Gy / dia / tumor para duas frações, dose total = 10 Gy, e os experimentos terminaram 2 dias após o término dos tratamentos de anticorpos. Os tumores foram extraídos e FFPE seções foram preparados para imunofluorescência para seguir o procedimento padrão: as lâminas foram deparaffinized e reidratados e antígenos foram obtidos por 40 min em um tampão citrato (pH 6.1) a 95 °C. Para remover autofluorescence, slides foram socked de autofluorescence solução de (0,5 M de CuSO4, 0,05 M NH4COOH em H2O) no RT para 48 h, lavado com água 5 min 3vezes, em seguida, bloqueado com 1:100 cavalo de soro. A incubação primária de anticorpos foi feita a 4 °C durante a noite: anti-GFP (1: 100; Dako), Anti-CD11b (1:100; Millipore); Após lavagem, as lâminas foram incubadas com 1: 250 anticorpos secundários diluídos fluorescentes conjugados (rodamina para CD11b, Alexa Fluor 488 para GFP) em RT durante 1 h E depois montadas com solução Antifade Vectashield contendo DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). A fagocitose mediada por macrófagos foi detectada por microscopia fluorescente utilizando o software Axiovision (Zeiss, Alemanha) e os microfotógrafos foram quantificados pelo ImageJ.

análise estatística

todos os dados experimentais obtidos a partir de estudos celulares in vitro e testes em animais são apresentados como média ± SE, analisados utilizando o teste t-Student de duas caudas para dois grupos ou ANOVA para vários grupos. A significância estatística das curvas de sobrevivência Kaplan–Meier foi avaliada com um teste de Mann–Whitney. O número de experimentos independentes e os replicados foram indicados nas lendas das figuras. Os valores de P < 0,05 foram considerados significativos e são indicados por asteriscos da seguinte forma: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < de 0,001, ****P < 0.0001.o resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção da investigação.