Encephalitozoon cuniculi Deformação III É uma Causa de Encephalitozoonosis de Ambos os seres Humanos e Cães

após a morte, os tecidos foram colhidos assepticamente e homogeneizados (Ten Broeck tissue homogeneizer; Corning, Corning, NY) usando PBS, pH 7.2, mais 2× solução antibiótica-antimicótica (Gibco, Gaithersburg, MD). Os esporos microsporidiais foram purificados a partir de um homogeneizado de tecido hospedeiro utilizando um método previamente descrito de gradiente de densidade Percoll modificado, alterando a velocidade de centrifugação para 600 g. Os microsporídios foram cultivados em células RK-13 (ATCC CCL-37) utilizando meio RPMI 1640 complementado com 5% de soro fetal bovino e 2× solução antibiótica-antimicótica (Gibco), como descrito anteriormente . A cultura de parasitas e a análise do ADN foram feitas ao longo de vários meses, com base na recepção das várias amostras de casos, pelo que a possibilidade de contaminação cruzada acidental foi negligenciável.isolamento do ADN

para isolados 1-6 e 8, os parasitas foram cultivados em cultura de curto prazo para gerar esporos adequados para caracterização molecular. Para o isolado 7, os parasitas foram purificados directamente do tecido cerebral do cachorrinho fresco para isolamento do ADN. Para a maioria dos isolados, o DNA foi extraído de esporos purificados usando matriz Instagene (BioRad, Hercules, CA), seguindo o protocolo do fabricante para culturas bacterianas . Para alguns dos trabalhos moleculares com isolados 6 e 8, esporos foram processados como descrito anteriormente, e o DNA foi extraído de esporos por um método padrão de extração de fenolclorofórmicos usando um sistema de tubos de microfuge em gel de particionamento (sistema de Gel de fase leve de bloqueio; 5 Prime→3 Prime fabricante, Westchester, PA) para otimizar a recuperação de DNA. O ADN foi precipitado com etanol, o sedimento foi ressuspendido em TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6), e a concentração de ADN foi estimada utilizando razões A260 : A280 por espectrofotometria UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA extraído de esporos derivados de culturas de tecidos de Encefalitozoon hellem foi usado como um controle positivo, e um controle negativo apenas reagente foi incluído em todas as reações de extração e sequenciamento.sequenciamento parcial e análise do ADN da subunidade do gene do ADN ribossómico (SSU rRNA)

uma porção da extremidade do gene SSU rRNA de 5′ de cada um dos 8 isolados foi amplificada utilizando o par primer PMP1 e PMP2, como descrito anteriormente . A reação em cadeia da polimerase (PCR) para cada isolado foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (reagentes de núcleo GeneAmp PCR, N808-0009; sistemas moleculares Perkin-Elmer Cetus/Roche, Branchburg, NJ). A amplificação foi feita em um ciclador térmico (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Após desnaturação inicial de 5 minutos a 95 ° C, A Taq polimerase (0,5 U) foi adicionada a cada reacção de 25 µL. As amostras foram então submetidas a 35 ciclos de desnaturação (94°C, 30 s), recozimento (60°C, 30 s) e extensão (72°C, 1 min), seguidos de 10 minutos a 72°C para a extensão final. Os nucleótidos não incorporados foram removidos usando colunas cromatográficas (Micro Bio-Spin 30; BioRad). As amostras foram mantidas a 4 ° C até serem processadas para sequenciação automática.

análise de ADN da sua região

uma porção da sua região do gene de ARN ribossómico de cada isolado foi amplificada por PCR com o par primário int530f e int580r , usando os métodos de amplificação descritos acima. O produto PCR resultante foi sequenciado em um sequenciador de DNA automatizado (modelo 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).o ADN amplificado por PCR de cada isolado foi amplificado para sequência automática com um kit comercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit).; Promega, Madison, WI) seguindo as instruções do fabricante. Todas as reações foram executadas em um termociclador (MJ Research Minicycler). As amostras foram então submetidas a 35 ciclos de desnaturação (94°C, 30 s), recozimento (60°C, 30 s) e extensão (72°C, 1 min), seguidos de 10 minutos a 72°C para a extensão final. Os produtos de extensão foram purificados usando colunas de cromatografia (Micro Bio-Spin; BioRad), secos em uma centrifugadora de vácuo (Savant Instruments, Holbrook, NY), e armazenados a -20°C até sequenciados em um sequenciador automático (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

By use of alignment software (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI), consensus sequences of ∼265 bases were obtained for a portion of the SSU rRNA gene for each parasite isolate. Estas sequências foram avaliadas para homologia contra sequências de Encefalitozoon previamente relatadas na base de dados NCBI GenBank usando uma simples pesquisa BLASTN.

teste de mobilidade heteroduplexo de ADN de cadeia dupla

ADN do isolado 6 foi amplificado por PCR com o par primário int530f e int580r como descrito anteriormente . The PCR-amplified products were assayed for the generation of heteroduplexes and homoduplexes using previously characterized isolates of E. cuniculi from various hosts.foram estabelecidos, no total, 8 isolados parasitários de 4 focos clínicos distintos em cultura de tecidos. Tanto características microscópicas leves como características de crescimento in vitro dos parasitas sugeriram que eles eram E. cuniculi, um microsporidiano anteriormente relatado em cães, bem como outros hospedeiros. Parcial de seqüenciamento de 5′ cada fim de isolar a SSU rRNA de genes (GenBank AF144246–AF144253) confirmou a parasitas’ identidade como E. cuniculi, desde que todas as amostras mostraram 100% de homologia com o anteriormente publicado sequências (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

Heteroduplex analysis and sequencing of the ITS region of the ribosomal RNA gene further characterized all of the dog isolates as strain III, confirming previous reports of subtle variations among E. cuniculi isolates from various roedores, rabbit, and human hosts. A figura 1 ilustra a formação do homoduplexo de DNA entre o isolado canino 6 e um isolado da estirpe III previamente caracterizado, bem como a formação heteroduplexa entre o isolado 6 e as outras estirpes E. cuniculi.

discussão

a importância biológica de várias estirpes de E. cuniculi ainda não foi clarificada; no entanto, a capacidade de distinguir entre estirpes de parasitas pode constituir uma ferramenta para rastrear fontes de infecção em estudos epidemiológicos. Os nossos dados moleculares identificando 8 isolados microsporidianos de cães como E. cuniculi estirpe III concordam com um estudo anterior que classificou 2 isolados caninos como estirpe III. Foram notificados isolados de coelhos, ratos e raposa como estirpes i ou II. Estes dados sugerem que a estirpe III pode estar predominantemente associada a cães. Os isolados humanos foram identificados como estirpe III no hemisfério ocidental e como estirpe i na Europa . Embora a(S) Fonte (s) de Exposição Humana A E. cuniculi é Desconhecido, há cada vez mais evidências de que os animais podem servir como reservatórios de infecção, e há uma possibilidade de transmissão zoonótica do organismo entre animais e pessoas. É uma possibilidade interessante que geográfica e das diferenças culturais na adopção de animais de estimação podem desempenhar um papel na exposição humana, desde que os cães são animais domésticos comuns nos Estados Unidos, enquanto os coelhos são frequentemente mantidos como animais de estimação ou como alimento na Suíça e outros países Europeus.o exame de amostras fecais e urinárias dos pais de Boston Terrier clinicamente normais e de 1 filhote da ninhada 1 revelou níveis baixos de escória durante 4 meses após a morte de ninhada (isolados 1-5; dados não publicados). Esta observação sugere ainda um possível mecanismo para a transmissão direta ou indireta dos parasitas dos cães para os seres humanos através da contaminação de ambientes localizados com excreções urinárias e fecais de cães. Embora nenhum estudo epidemiológico tenha avaliado a relação entre propriedade/exposição do pet e infecções microsporidiais humanas, num único caso em que as crianças foram expostas a cachorros com encefalitozoonose evidente, 1 de 3 crianças foi seroconvertida . Outros isolados E. cuniculi de vários hospedeiros precisam ser analisados para avaliar melhor o risco de manutenção de animais de estimação potencialmente infectados nas famílias de pessoas imunocomprometidas com alto risco de infecções microsporidiais.Agradecemos aos Laboratórios De Diagnóstico Médico Veterinário Jay Hoffman, Joanne Mansell e Bruce Abbitt por fornecerem tecidos caninos para este estudo.