Frontiers in Pharmacology

a transição entre os Estados fechados e abertos ocorre por eventos locais de desdobramento. Em condições nativas, em que as proteínas são bem dobradas, a taxa HDX depende principalmente da taxa de transição de volta para o estado fechado (Weis et al., 2006). Se a região da proteína não dobrada retornar ao estado fechado a uma taxa muito mais lenta do que a taxa de câmbio química, cinética EX1 é observada, resultando na absorção de Deutério correlacionado em resíduos vizinhos. Isto resulta em duas populações: uma com baixo m/z e uma com alto m/z, refletindo peptídeos de moléculas proteicas que não foram e que foram submetidas a troca, respectivamente. Com o tempo, a alta população m/z torna-se mais proeminente à custa da baixa população m/Z. A cinética EX1 é considerada rara em proteínas dobradas em condições nativas, mas pode ser induzida, por exemplo, pela adição de desnaturantes (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Se a proteína retornar ao estado fechado a uma taxa muito mais rápida do que a taxa de câmbio química, cinética EX2 é observada. Aqui, a troca depende da transição de resíduos individuais entre o estado aberto e fechado, ocorrendo de forma não correlacionada. Assim, com o tempo, observa-se uma única população com valores gradualmente crescentes de m/z (Weis et al., 2006).

Após a deuteração, a reacção é atenuada em pontos temporais pré-definidos, alterando o pH de neutro (7) para pHmin (2.5–3), resultando numa redução de cerca de 10 000 vezes em HDX (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); e reduzindo a temperatura de 25 ° C para 0 ° C, levando a ~14 vezes a diminuição em HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Em seguida, a proteína é digerida usando uma protease e os peptídeos são separados usando cromatografia analítica de fase reversa. Atualmente, o principal gargalo técnico dos experimentos HDX-MS reside na obtenção de uma cobertura de alta sequência, que é limitada pela resistência às enzimas digestivas e por condições proteolíticas. Por último, os peptídeos eluídos são identificados utilizando MS e o grau de HDX é calculado com base nos valores obtidos de m/Z. Os detalhes experimentais e as armadilhas da digestão de proteínas, separação peptídica e identificação de MS estão fora do âmbito desta revisão (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).apesar de partilharem o paradigma de acesso alternado, as mudanças conformacionais induzidas pelos ligandos diferem entre os transportadores devido a diferenças nas interações ligando-proteínas. Por exemplo, sympressers (Co-transportando dois ou mais ligandos) podem transitar entre o fi e os estados sem ligantes, enquanto ligando ligando é obrigatório para troca entre o fi e dos Estados em antitransportadores (trocando ligandos em lados opostos da membrana) (Forrest et al., 2011; Drew and Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

em geral, detectar mudanças dinâmicas locais induzidas pelos ligandos nas proteínas é difícil. Por exemplo, as estruturas cristalinas das proteínas membranares nas formas livre de ligando e ligando estão frequentemente indisponíveis, impedindo a detecção de mudanças conformacionais induzidas por ligando mesmo para proteínas com estruturas conhecidas. Além disso, os instantâneos estruturais de alta resolução dos estados da apo e ligando podem não resolver diferenças conformacionais significativas. No entanto, pequenas alterações conformacionais induzidas pelos ligandos podem ser detectadas usando HDX-MS em subdomínios proteicos específicos em condições nativas, medindo a absorção diferencial de Deutério (ΔHDX) na presença e ausência de ligantes. Esta capacidade da HDX-MS oferece oportunidades únicas para abordar os problemas mais desafiadores na elucidação dos mecanismos de interações proteína-ligando e proteína-proteína (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), conforme revisado aqui para uma série de proteínas de transporte recentemente estudadas.

transições conformacionais subjacentes ao acesso alternado: as proteínas Na+/H+ Antiporter

Nha regulam o pH celular, e o volume ao longo dos reinos da vida (Padan e Landau, 2016). O principal modelo estrutural utilizado para o estudo de ortologia Nha é Escherichia coli NhaA, para o qual está disponível uma estrutura cristalográfica do estado inactivo a pH ácido (Hunte et al., 2005). Para estudar a dinâmica estrutural do NhaA sob pH fisiológico, HDX-MS foi recentemente utilizado (Eisinger et al., 2017). Crucial para os insights obtidos neste estudo, o HDX-MS fornece dados dinâmicos globais, em contraste com métodos baseados na rotulagem específica do local, que apenas detectam movimentos de regiões proteicas pré-definidas.neste estudo, obteve-se uma cobertura de sequência excepcionalmente elevada de 88,5% para a NhaA no detergente, fornecendo informações sobre o mecanismo subjacente ao acesso alternado ao ligante. Ao comparar os padrões de HDX entre a APO e a Nha ligada ao substrato, observou – se um padrão recorrente de alteração do HDX em várias hélices, onde o aumento da absorção de Deutério num terminal foi acompanhado por uma diminuição da absorção de Deutério no outro terminal. A captação no meio das hélices manteve-se praticamente inalterada.

com base no padrão observado de mudança HDX, embora não fornecendo diretamente informação espacial, foi sugerido que a tradução das hélices transmembranares em relação à membrana ocorre, como refletido nas mudanças recíprocas de HDX observadas para as duas terminações dentro de hélices transmembranares específicas. Este modelo é consistente com o Mecanismo” Tipo Elevador ” de acesso alternado, implicando uma tradução vertical de hélices transmembranares durante o ciclo de transporte (Ryan e Vandenberg, 2016). Em resumo, o HDX-MS forneceu novos insights sobre as transições estruturais envolvidas na alternância de acesso, inatingível pelas estruturas previamente resolvidas do inativo NhaA.

Effect of Protein-Lipid Interactions on Transporters ‘ Conformation Landscapes

a maioria dos transportadores secundários pertencem ao maior facilitador superfamília( MFS), compartilhando uma arquitetura conservada apesar de suas diversas funções (Radestock e Forrest, 2011). Embora as estruturas cristalinas dos membros do MFS estejam disponíveis, eles forneceram pouca informação sobre interações proteína-lipídicas e seu efeito sobre o equilíbrio entre os Estados De OF E IF. Assim, Martens et al. simulações combinadas de MD com HDX-MS para estudar os efeitos do ambiente lipídico em três transportadores bem caracterizados: lactose permease, xilose transporter e glicerol-3-fosfato antiporter (Martens et al., 2018).em primeiro lugar, uma mutação conhecida por deslocar o equilíbrio para o estado foi introduzida no vestíbulo extracelular de todos os transportadores (Kumar et al., 2014). Comparando os transportadores WT e mutados usando HDX-MS revelou que o método detecta a mudança conformacional, com regiões no vestíbulo extracelular tomando mais deutério nos mutantes versus o WT, enquanto o oposto ocorre para resíduos no vestíbulo intracelular. Em seguida, os transportadores foram reconstituídos em nanodisks compostos de fosfatidilglicerol, cardiolipina tetraoleil e fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina. Curiosamente, a presença de fosfatidiletanolamina deslocou o equilíbrio para o estado IF. Subseqüentemente, MD simulações dos transportadores em bilayers lipídicos idênticos à composição de nanodisks previram interações diretas entre o headgroup de fosfatidiletanolamina carregado e uma rede citoplasmática conservada de resíduos carregados, estabilizando o estado (Doki et al., 2013). A alteração dos resíduos carregados aboliu o efeito da fosfatidiletanolamina, sugerindo fortemente que interacções específicas entre as proteínas fosfatidiletanolamina e proteínas controlam o equilíbrio intrínseco dos transportadores. This study is a stark example of combining experimental and computational methods in order to identify subtle but funcionally significant protein-lipid interactions.

Hélice Desenrolar Durante o Transporte: Estudos de LeuT

LeuT é um procariontes homóloga do neurotransmissor/Na+ symporters (NSS) família, que inclui importantes alvos de medicamentos, tais como a serotonina, dopamina e noradrenalina transportadores (Kristensen et al., 2011). LeuT foi amplamente estudado ,e suas estruturas cristalográficas ao longo do ciclo de transporte estão disponíveis (Focke et al., 2013). Estas estruturas sugeriram que rearranjos estruturais em larga escala são necessários durante o acesso alternado (Krishnamurthy e Gouaux, 2012). No entanto, a paisagem conformacional que permite a transição entre a fi e os Estados permanece esquiva e controversa.

para estudar a transição entre diferentes estados, foi investigada a lixivia detergente-solubilizada sob condições que favorecem o fi ou de Estados (Merkle et al., 2018). Surpreendentemente, muitos peptídeos, principalmente no lado intracelular do transportador, exibiram cinética EX1. Isto é bastante incomum em proteínas dobradas em condições nativas e considerado para refletir um desdobramento de longa vida de elementos de estrutura secundária. Com base na distribuição espacial de peptídeos que exibem cinética EX1, juntamente com as estruturas cristalográficas disponíveis, foi proposto que hélices específicas sofram descompressão parcial durante o acesso alternado e que essas mudanças conformacionais também contribuem para a liberação do substrato. Este estudo destaca a importância funcional das mudanças conformacionais lentas (seconds time scale) que podem ser bem resolvidas usando HDX-MS, em contraste com outros métodos experimentais ou computacionais (por exemplo, MD).

hidrogénio-Deutério troca espectrometria de massa de proteínas de membrana em Nanodisks lipídicos

as interacções das proteínas de membrana com lípidos circundantes podem modular dramaticamente a sua função (Vadas et al., 2017). De facto, a actividade dos membros eucarióticos da NSS depende significativamente de interacções lipídicas-proteicas específicas que modulam a dinâmica proteica e, consequentemente, interacções com substratos (Divito e Amara, 2009). Portanto, Adhikary et al. LeuT estudado reconstituído em nanodisks bicamados fosfolípidos (Adhikary et al., 2017). Usando esta abordagem, LeuT foi investigado sob condições que favorecem o fi e de conformações. A comparação dos padrões HDX entre estes estados revelou alterações específicas nas regiões anteriormente implicadas no ciclo de transporte, reflectindo mudanças estruturais funcionalmente significativas. Curiosamente, os dados HDX-MS, consistentes com estudos biofísicos e computacionais anteriores, suportaram um menor ângulo de inclinação para a primeira hélice transmembranar na conformação IF em comparação com o observado nas estruturas de cristal. Esta diferença foi atribuída ao ambiente lipídico, uma vez que a estrutura cristalina foi obtida em detergente com uma quantidade mínima de lípidos. Para resumir, a HDX-MS fornece uma plataforma flexível para estudar proteínas de membrana em diferentes ambientes hidrofóbicos e em condições que favoreçam Estados conformacionais específicos, sem a necessidade de rotulagem específica do local.

interações iónicas com múltiplos locais: o permutador de Na+/Ca2+

NCX participa na homeostase celular Ca2+ extraindo Ca2+ das células contra o seu gradiente electroquímico (Blaustein e Lederer, 1999). NCX Exchange 3Na+: 1Ca2+, em que Na+ e Ca2+ são transportados em fases separadas (Khananshvili, 1990). Surpreendentemente, a estrutura cristalina de NCX de Metanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) revelou quatro locais de ligação iônica, simultaneamente ocupados por três na+ íons em locais denominados Sint, Smid, Sext, e um íon Ca2+ em um local chamado SCa (Liao et al., 2012). Como este modo de ligação era inconsistente com estudos anteriores, simulações MD e análises de fluxo iônico de Mutantes foram realizadas, sugerindo que na + ions ocupam Sint, SCa e Sext, enquanto Ca2+ ocupa SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Assim, os íons Na+ e Ca2+ são ligados de forma mutuamente exclusiva ao longo do ciclo de transporte.

para estabelecer experimentalmente a atribuição de locais de ligação iônica, comparamos o estado apo com os estados de ligação iônica de NCX_Mj usando HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Apesar da cobertura de baixa sequência, a nossa análise incluiu 10 dos 12 resíduos coordenadores de iões. Detectamos uma diminuição dependente de na+na captação de deutério em Sint, SCa e Sext, mas não Smid, enquanto na presença de Ca2+ a diminuição na captação de Deutério foi observada principalmente em SCa. Isto é consistente com as previsões feitas pelas simulações MD e análises mutacionais prevendo a ocupação de Smid por uma molécula de água, mas não por Na+ ou Ca2+ no estado do solo (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Notavelmente, estudos cristalográficos subsequentes validaram a atribuição dos nossos sítios de ligação (Liao et al., 2016). Assim, HDX-MS corroborou o modo de ligação iônica sugerido pelos estudos computacionais e funcionais.o permutador mitocondrial na+/Ca2+ (NCLX) apresenta uma selectividade iónica excepcional, trocando Ca2+ com Na+ ou Li+, enquanto que os NCX não transportam Li+ (Palty et al., 2010). Embora a relevância fisiológica desta seletividade iônica permaneça intrigante, é notável que 9 (de 12) resíduos coordenadores iônicos em NCLX diferem daqueles em NCXs e outros membros da superfamília antiporter Ca2+/cation. Para entender como essas diferenças afetam o reconhecimento e transporte de ligação iônica, realizamos a substituição baseada na estrutura de resíduos de coordenação iônica em NCX_Mj para imitar os locais de ligação NCLX (Refaeli et al., 2016). Surpreendentemente, a construção recém-projetada (denominada nclx_mj) mediata Na+/Ca2+ e Li+/Ca2+ com valores de Km comparáveis (Refaeli et al., 2016).

A seguir, procurámos determinar se os sítios de ligação iónica em NCLX_Mj são reminiscentes daqueles de Ncx_mj (Giladi et al., 2019). Análises HDX-MS de alterações conformacionais induzidas por iões revelaram que o SCa se liga a Na+, Li+ ou Ca2+, enquanto que um ou mais sites adicionais de Na+/Li+ de NCLX_Mj são incompatíveis com os sites originais de Na+ (Sext e Sint) atribuídos a NCX_Mj. Estes resultados sugeriram que NCLX_Mj pode transportar iões com uma estequiometria eletrônica de 2Na+: 1Ca2+ ou 2Li+: 1Ca2+. Consistente com os dados HDX-MS, o aperto de tensão acelera as taxas de câmbio Na+/Ca2+ em proteolipossomas NCX_Mj-reconstituídos (devido a uma estequiometria de 3Na+:1Ca2+), enquanto que não tem efeito apreciável nas taxas de câmbio na+/Ca2+ ou Li+ / Ca2+ em Nclx_mj (Giladi et al., 2019).os nossos estudos demonstraram a utilidade da HDX-MS na identificação e validação de locais de ligação em transportadores iónicos, onde diferenças relativamente pequenas nos sinais ΔHDX iónicos induzidos fornecem informações importantes sobre a selectividade iónica e as alterações conformacionais que ocorrem aquando da ligação iónica em locais distintos. Assim, combinado com simulações MD e cristalografia de raios X, HDX-MS é especialmente atraente para elucidar os determinantes estruturais da seletividade iônica e mudanças conformacionais induzidas por iões em sistemas de transporte iônico que incluem múltiplos locais de ligação iônica.

conclusões

ao longo das últimas décadas, a biologia estrutural tem contribuído enormemente para a nossa compreensão da função proteica da membrana, principalmente fornecendo instantâneos estáticos de estados discretos em alta resolução. Para decifrar completamente as relações estrutura-função subjacentes ao complexo processo de transporte de soluto, um número crescente de métodos experimentais e computacionais foram desenvolvidos para colmatar o fosso entre esses instantâneos estáticos e determinar as paisagens conformacionais subjacentes. HDX-MS é cada vez mais usado para estudar proteínas de membrana intactas sob várias condições quase nativas, proporcionando novas oportunidades para estudar interações membrana-proteína, reconhecimento de substrato e transições conformacionais relacionadas ao transporte. Os futuros desenvolvimentos na automação de instrumentação e análise de dados podem permitir o uso de HDX-MS em alta produtividade, explorando plenamente seu potencial uso em pesquisa básica e aplicações biomédicas, como a concepção de drogas.

contribuições dos autores

MG e DK revisaram a literatura e escreveram o manuscrito.Este trabalho foi apoiado pela Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) e pela Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). O apoio financeiro do Prémio Shmuel Shalit à DK é reconhecido com gratidão.

conflito de interesses

os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.