Frontiers in Plant Science

Introdução

Embora a luz é a força motriz da fotossíntese, a luz alta pode causar significativo photoinhibition de photosystem II (PSII) para folhas de sombra-o estabelecimento de plantas (Kitao et al., 2000; Barth et al., 2001; Krause et al., 2004; Huang et al., 2015b, 2016b, c). No entanto, PSII photoinibited recupera rapidamente em baixa luz (He e Chow, 2003).; Zhang and Scheller, 2004, Allakhverdiev et al., 2005), devido à rápida taxa de rotação da proteína D1 (Aro et al., 1993; Zhang and Scheller, 2004; Allakhverdiev et al., 2005). A taxa de reparação do PSII foi reduzida após a inibição da síntese do ATP quer via PSI quer PSII (Alakhverdiev et al., 2005), indicando que a reparação rápida de complexos PSII fotodamaged precisa de uma grande quantidade de ATP em um curto período de tempo. Um estudo anterior indicou que após a fotoinibição induzida pela refrigeração do PSII, o fluxo de elétrons cíclicos (CEF) foi significativamente estimulado durante a recuperação a baixa luz (Huang et al., 2010). It was proposed that this stimulation of CEF at low light enhanced the synthesis of ATP for the fast repair of PSII (Huang et al., 2010). No entanto, mais evidências são necessárias para clarificar o papel específico da estimulação da CEF a baixa luz após a fotoinibição da PSII.durante o CEF, os electrões da NADPH ou da ferredoxina são ciclados em torno da PSI para o pool de plastoquinona. Esta transferência de elétrons é acoplada à translocação de prótons e gera um gradiente de prótons através das membranas thylakoid (ΔpH) (Shikanai e Yamamoto, 2017). Além de contribuir com a síntese de ATP, outra função do ΔpH é a Down-regulation do transporte de elétrons fotossintéticos acidificando o lúmen tilacóide (Shikanai, 2014, 2016). Este Regulamento envolve dois mecanismos diferentes: um Está ligado à dissipação de energia térmica e dissipa o excesso de energia absorvida como o calor de antenas PSII (Takahashi et al., 2009), e o outro é down-regulation da atividade complexa Cyt b6/f e controla a taxa de transferência de elétrons para PSI (Suorsa et al., 2012, 2016; Tikkanen e Aro, 2014). Em angiospérmicas, incluindo Arabidopsis thaliana, duas vias de Transporte Eletrônico PSI Cíclico estão operando (Shikanai, 2007). A primeira via CEF é a via dependente da PGR5-/PGRL1 sensível à antimicina a (Munekage et al., 2002; Sugimoto et al., 2013), e o outro é dependente do complexo chloroplast NADH desidrogenase (NDH) (Burrows et al., 1998; Shikanai et al., 1998). A contribuição da via dependente do PGR5 – /PGRL1 é mais significativa nas plantas C3. Sob alta luz, a ativação do CEF dependente do PGR5 – /PGRL1 induz a acidificação do lúmen tilacóide e, assim, leva aos altos níveis da razão de oxidação P700 (Suorsa et al., 2012, 2016; Kono et al., 2014; Yamori et al., 2016). Por comparação, a razão de oxidação P700 a baixa luz foi pouco afetada pela deficiência em CEF dependente de PGR5-/PGRL1 (Munekage et al., 2002, 2004; Kono et al., 2014). Após a fotoinibição moderada da PSII, a estimulação da CEF a baixa luz foi acompanhada com um aumento na ração de oxidação P700 (Huang et al., 2010). No entanto, não é claro se este aumento da razão de oxidação P700 é causado pela estimulação da CEF.

além do CEF, a transferência de elétrons de PSII (ETRII) desempenha um papel importante na afetação do estado redox de PSI (Tikkanen et al., 2014; Huang et al., 2016a, c; Suorsa et al., 2016). Em plantas da Pgr5 de A. thaliana, é provável que a fotoinibição severa de PSII funcione como o controle final da transferência de elétrons fotossintéticos, permitindo a manutenção de P700 oxidado otimicamente sob excesso de luz (Tikkanen et al., 2014). Recentemente, Suorsa et al. (2016) indicou que as plantas pgr5 apresentavam alta razão de oxidação P700 sob alta luz quando o ETRII foi reduzido combinando mutações knockouts em PsbO1, PsbP2, PsbQ1, PsbQ2 e PsbR loci. Em folhas refrigeradas de tabaco, a fotoinibição moderada de PSII reduziu o fluxo de elétrons para PSI e, em seguida, aumentou a razão de oxidação de P700 durante outros tratamentos de refrigeração (Huang et al., 2016a). Além disso, a fotoinibição de PSII induzida por refrigeração levou a uma depressão de ETRII, que foi acompanhada com um aumento na razão de oxidação P700 a baixa luz (Huang et al., 2010). Nós imaginamos que a razão de oxidação P700 a baixa luz é controlada principalmente pelo fluxo de elétrons de PSII.no nosso relatório anterior, observámos que a planta de criação de sombra Panax notoginseng mostrou uma fotoinibição selectiva de PSII sob forte pressão da luz. Após a exposição a curto prazo ao stress de alta luz, ETRII a baixa luz diminuiu significativamente, mas a CEF foi significativamente estimulada. Concomitantemente, a razão de oxidação P700 aumentou em grande parte. Nossos objetivos específicos foram (1) investigar se a estimulação do CEF a baixa luz principalmente facilita a síntese de ATP; and (2) determine whether the increase in P700 oxidation ratio upon moderate PSII photoinhibition is more related to ETRII rather than the CEF stimulation or the change in pmf. Para responder a estas questões, as folhas intactas de Panax notoginseng foram tratadas a 2258 µmol fótons m-2 s-1 durante 30 minutos. Antes e depois do tratamento com alta luz, foi determinada a distribuição de energia em PSII, o estado redox da força motriz de PSI e protões (pmf) a uma luz baixa de 54 µmol fótons m-2 s-1.no presente estudo, foram utilizadas plantas com 2 anos de idade com Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. Chow e W. G. Huang para experiências. Estas plantas foram cultivadas em condições de luz solar de 10% (com intensidade de luz média máxima de aproximadamente 200 µmol fótons m-2 s-1). Nenhuma pressão de água e nutrição foi experimentada para estas plantas. As folhas totalmente expandidas com 9 semanas de idade foram usadas para as medições fotossintéticas.as medições do fotossistema I e do PSII foram registadas simultaneamente a 25°C utilizando um sistema de medição duplo PAM-100 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha). Os parâmetros de fluorescência da clorofila foram calculados do seguinte modo: Fv/Fm = (Fm – Fo)/Fm, Y(II) = (Fm’ – Fs)/Fm’ (Genty et al., 1989), NPQ = (Fm – Fm’)/Fm’. Fo e Fm são a fluorescência mínima e máxima após aclimatação a escuro, respectivamente. Fs é a fluorescência em estado estacionário adaptada à luz. Os Fo e Fm foram determinados após aclimatação escura durante 30 minutos antes e depois do tratamento com alta luz. Os parâmetros fotossintéticos da PSI foram medidos por dupla PAM-100 com base no sinal P700 (diferença de intensidades de 830 e 875 nm de luz de medição modulada por impulsos atingindo o fotodetector) (Klughammer e Schreiber, 2008). Os sinais P700+ (P) podem variar entre um mínimo (P700 totalmente reduzido) e um nível máximo (P700 totalmente oxidado). O nível máximo (Pm) foi determinado com a aplicação de um pulso de saturação (600 ms e 10000 µmol fótons m-2 s-1) após a pré-iluminação com luz muito vermelha, e as Pm foram utilizadas para estimar a atividade PSI. Pm ‘ foi determinado semelhante à Pm, mas com luz actínica em vez de luz muito vermelha. The quantum yield of PSI was calculated as Y (I) = (Pm’- P)/Pm. A razão de oxidação P700 numa dada Luz actínica foi calculada como Y (ND) = p/Pm. O rendimento quântico da dissipação de energia não fotoquímica PSI devido à limitação do lado do aceitador foi calculado como Y (NA) = (Pm-Pm’)/Pm. Os valores em estado estacionário para Y(II), NPQ, Y(I) e Y(ND) foram medidos após aclimatação da luz a uma luz baixa durante 20 minutos.

fluxo de elétrons fotossintéticos através de PSI e PSII foram calculados como: ETRII = Y (II) ×PPFD ×0,84 ×0,5 (Krall e Edwards, 1992), ETRI = Y (I) ×PPFD×0,84 ×0,5 (Yamori et al., 2011), onde 0,5 é assumido como sendo a proporção de luz absorvida alcançando PSI ou PSII, e 0,84 como sendo a absorvância (a fração da luz incidente absorvida pelas folhas). A extensão da activação do CEF foi estimada como razão ETRI/ETRII (Yamori et al., 2011, 2015). Note-se que o particionamento de excitação 1:1 entre PSI e PSII pode não ser real, porque as plantas de sombra tendem a aumentar a razão PSII/PSI (Lunde et al., 2003; Tikkanen et al., 2006; Grieco et al., 2012). Além disso, neste estudo, os parâmetros PSI e PSII foram medidos utilizando a luz actínica vermelha (635 nm) fornecida pela Dual-PAM 100 (Walz, Alemanha). Como a luz actínica vermelha favorece a excitação de PSII sobre a de PSI, a distribuição de energia de excitação de LHCII a PSII e PSI pode ser afetada pela luz actínica vermelha (Tikkanen et al., 2017).

Análise de deslocamento electrocrómico

o sinal ECS foi monitorizado à medida que a mudança de absorvância a 515 nm, utilizando um duplo PAM-100 (Walz, Effeltrich, Alemanha) equipado com um módulo P515/535 detector de emissores (Walz). O sinal ECS foi obtido após 20 minutos de iluminação a 54 µmol fótons m-2 s-1, depois o decaimento ECS foi medido desligando a luz actínica durante 30 s. a análise da cinética de relaxamento do intervalo ECS escuro (DIRKECS) foi feita pelo método de Sacksteder et al. (2001) and Takizawa et al. (2008). O total de pmf foi estimado a partir da amplitude total do decaimento rápido do sinal ECS durante o intervalo escuro de 300 ms. O relaxamento lento do sinal ECS permitiu reconhecer a contribuição do gradiente de protões através das membranas tilacóides (ΔpH). A constante de tempo do relaxamento ECS de primeira ordem (tECS) é inversamente proporcional à condutividade de prótons (gH+) da membrana tilacóide através da ATP sintase (Sacksteder e Kramer, 2000; Cruz et al., 2005). Como resultado, GH+ foi estimado como o inverso da constante de tempo de decaimento .os tratamentos Fotoinibitórios após aclimatação escura durante 30 minutos, FV/Fm e Pm foram medidos em folhas intactas. Posteriormente, estas folhas intactas foram adaptadas à luz a 59 µmol fótons m-2 s – 1 durante 20 minutos e foram registados parâmetros de fluorescência Clorofila, sinal P700 e sinal ECS. Em seguida, a luz actínica foi alterada para 2258 µmol fótons m-2 s-1. Após a exposição a esta luz elevada durante 30 minutos, a luz actínica foi alterada para 59 µmol fotões m-2 s-1 imediatamente e os parâmetros fotossintéticos foram registados após a aclimatação da luz durante 20 minutos. Finalmente, FV / Fm e Pm foram medidos após aclimatação escura durante 30 minutos.

análise estatística

os resultados foram apresentados como valores médios de cinco experiências independentes. O teste t independente foi utilizado a um nível de significância α = 0, 05 para determinar se existiam diferenças significativas entre os diferentes tratamentos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 16.0.resultados

resultados

durante a indução fotossintética a 59 µmol fótons m-2 s-1, ETRII aumentou gradualmente e atingiu um estado estacionário em cerca de 18 minutos (figura 1A). Por comparação, o ETRI foi constante durante esta fase de indução (figura 1A). Após o início desta luz baixa, ETRI foi muito maior do que ETRII. No entanto, após uma indução fotossintética de 20 minutos, o ETRI foi inferior ao ETRII. Estes resultados sugeriram a ativação do CEF durante a fase inicial de indução, de acordo com estudos anteriores (Joliot e Joliot, 2002, 2005; Makino et al., 2002). Após esta indução fotossintética a baixa luz, as folhas foram iluminadas a uma alta luz de 2258 µmol fótons m-2 s-1 durante 30 minutos. Curiosamente, ETRII diminuiu gradualmente durante o tratamento com luz elevada (figura 1B). Entretanto, o valor do ETRI foi superior ao do ETRII (figura 1B), indicando a ativação do CEF sob luz alta. Após este tratamento de alta luz, o P700 (Pm) fotooxidável máximo foi mantido estável (figura 2A). Em comparação,a intensidade máxima de fluorescência (Fm) diminuiu 40% e o rendimento quântico máximo de PSII (Fv/Fm) diminuiu de 0,80 para 0,65 (figuras 2B, C). Estes resultados indicaram a fotoinibição seletiva de PSII em folhas de Panax notoginseng sob tensão de alta luz.

Antes da alta-luz de tratamento, folhas maduras foram iluminados em uma luz fraca das 59 µmol fótons m-2 s-1 por 20 min para ativar a fotossíntese e, em seguida, os valores para ETRI, ETRII, Y(ND), e NPQ foram registrados. Após tratamento com alta luz durante 30 minutos, foram registados valores para ETRI, ETRII, Y(ND) e NPQ após uma nova fase de aclimatação de 20 minutos a baixa luz. Antes do tratamento com alta luz, os valores para ETRI e ETRII a 59 µmol fótons m-2 s-1 eram 13,4 e 15,7 µmol electrões m-2 s-1, respectivamente (figuras 3A,B). Após tratamento de alta luz, ETRI e ETRII a baixa luz foram 12,8 e 11,2 µmol elétrons m-2 s-1,respectivamente (figuras 3A, B). O valor de ETRII a 59 µmol fótons m-2 s-1 diminuiu cerca de 30% após o tratamento fotoinibitório, indicando a depressão de ETRII sobre a fotoinibição moderada de PSII. Antes do tratamento com alta luz, o valor da razão ETRI/ETRII a 59 µmol fótons m-2 s-1 era de 0, 85 (figura 3C). Após o tratamento fotoinibitório, a razão ETRI/ETRII aumentou significativamente para 1, 14 (figura 3C). Estes resultados sugeriram a estimulação da CEF a baixa luz sobre a fotoinibição de PSII (Yamori et al., 2011, 2015).