Experimentais
Rotulagem de RuBisCo:
Aedans(454): doador F(58): acceptor
Ligação Estudos:
Termos:
ADP-bala: GroEL complexo vinculado a GroES e ADP
ApoGroEL: Apenas GroEL comlex (usado em anterior vinculação de estudos da RuBisCo substrato)
Lin et al. determined that:
1. Havia uma diferença no FRET sobre o substrato ligando ao anel trans da bala ADP vs. anel apoGroEL.-isto foi evidente pela extinção da fluorescência do dador (B.)
– Isto indica uma diferença na conformação do substrato proteico.
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2. Encontrei um desdobramento” passivo ” de proteínas de substrato ligadas ao anel de apoGroEL.
– However, this unfolding occurred much slower than Groel’s functional reaction cycle.
3. Há um desdobramento menos “passivo” do substrato ligado ao trans-anel da bala ADP.- confirmou-o com estudos de digestão da protease.
– However, this is the more physiologically relevant complex.
– então este é um nível maximalmente eficaz, ou apenas o primeiro passo no ciclo de reação?
Para testar a relevância fisiológica, que adicionado a ATP ADP Bala de Reação, e monitorados TRASTE
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Após a adição de ATP, eles encontraram: – Uma primeira rápida, forçado a conformação de expansão do substrato – e, em seguida, um ritmo mais lento de compactação de fase – Evidente na Figura b |
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Figura-c indica que a cinética de compactação fase isdependent no GroES concentração, o que significa que é dependente
thesequestration mecanismo do complexo.
– enquanto a fase de expansão é independente da concentração de GroES.
Concluded there are two phases of Unfolding:
– Slow passive unfolding due to substrate bind to trans ring of GroEL Chamber(from first binding experiment)
– Rapid, ATP driven unfolding due to the conformation change of the GroEL chamber.
desdobramento rápido não é dependente de GroES:
– Um excesso de uma variante de GroEL de anel único, SR1 foi usado como uma Armadilha de GroES.
– SR1 is unable to bind substrate and catalyze an unfolding reaction, but is able to bind and sequester GroES to determine the dependency of reaction on the sequestration of the substrate.
– eles determinaram que o rápido desdobramento moniterado por FRET occuredwithout The GroES cap present, e a fase de compactação subseqüente não.
– Isto indica que a fase de expansão rápida é dependente da mudança de conformação de GroEL induzida pela ligação ATP.
Assim .. o desdobramento do substrato é necessário para a dobragem produtiva?este é um passo essencial e importante para o mecanismo de dobragem GroEL/GroES?
– eles descobriram que a fração de RuBisCo não nativo que emerge no estado nativo é proporcional à Extensão do desenvolvimento.
– Para examinar isso , eles queriam medir a lenta, passivo desenrolar do substrato devido à GroEL ligação sozinho(não ATP
dependente)
– Eles novamente utilizado SR1 de ligação para o substrato, desta vez não como atrap, mas como um passivo-desdobramento sítio de ligação para o substrato.
– O tempo de incubação com SR1 está correlacionado com a quantidade de desdobramento, uma vez que o desdobramento é devido apenas à ligação do substrato.
– eles determinaram que há uma correlação entre a quantidade de desdobramento para proteínas nativas.
– então o desdobramento forçado de GroEL / GroES é uma maneira eficiente de promover o mecanismo de desdobramento necessário para dobragem adequada de proteínas.
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