Humano de células T express CD25 e Foxp3 na ativação e exposição efetoras de memória/fenótipos, sem qualquer regulamentação/supressor de função

a Ativação de células T, induz a expressão de CD25 e Foxp3 associados com efetoras e de memória fenótipo diferenciação

PBMC foram estimulados com bryostatin-1 (5 nM) e ionomycin (1 µM) (B/I) na presença de 80 U/mL de IL-2 (Peprotech) para 16 h. A activação B / I imita sinais intracelulares que resultam na activação das células T através do aumento da actividade da proteína cinase C e do cálcio intracelular, respectivamente . As células foram lavadas três vezes e cultivadas a 106 células/mL em meio completo com 40 U/mL IL-2 (Peprotech) durante 3 dias e a expressão da Foxp3 foi determinada através da análise da citometria de fluxo. A expressão da FoxP3 também foi determinada em células T recém-isoladas no dia 0. Como mostrado na Fig. 1A (Painel superior), a presença de IL-2 isoladamente durante 3 dias não aumentou significativamente a expressão de Foxp3 ou CD25 acima dos níveis basais no dia 0 (Fig. 1C). A ativação B / I, no entanto, induziu a expressão Foxp3 e CD25 nas células CD4+ e CD8+ T (Fig. 1A, middle panel). Após a ativação B / I, as células CD4+CD25+Foxp3+ t foram aumentadas de 1% para 23% (P = 0, 016) e as células CD8+CD25+Foxp3+ T foram aumentadas de 0,6% para 9% (P = 0, 013). A extensão da cultura na presença de IL-2 para 6 dias sem qualquer outra estimulação mantidas CD4+CD25+Foxp3+ células T acima dos níveis basais em não-ativadas, as células T (1% vs 7%, P = 0.031) considerando que CD8+CD25+Foxp3+ células T, que caiu para níveis de linha de base (0.6%). Estes resultados sugerem que a expressão induzida pela ativação da Foxp3 nas células CD4+CD25+ T é mais estável do que nas células CD8+CD25+ T. O número absoluto de células T aumentou 3 e 6 dias após a estimulação B / I e expansão na presença de IL-2 (Fig. 1B). A activação das células T através de anti-CD3/CD28 Abs durante 3 dias produziu resultados semelhantes aos da activação B/i, aumentando as células CD4+CD25+FoxP3+ T de 0,4% para 8,7% (Fig. 1C). As análises de fenótipo das células T revelaram fenótipos CD44+ e CD44 + CD62L+ de memória antes e 6 dias após a activação B / I(fig. 1D, Painel superior). Enquanto as células T efetoras CD4+ e CD8+ foram reduzidas após a ativação (18% a 9% e 21% a 13%, respectivamente), as células T CD4+ e CD8+ foram aumentadas (82% a 91% e 79% a 87%, respectivamente). Após a ativação B / I, as células T CD4 + mostraram um aumento de 6 vezes da expressão FoxP3 em fenótipos CD44+, CD62L+ (CD44+: 2,6% a 15%; CD62L+: 2% a 12%). Além disso, ambas as células T CD4+ e CD8+ mostraram expressão de FoxP3high após a ativação em comparação com a expressão de FoxP3low no dia 0 (Fig. 1D, painéis médios e inferiores). Todas as células CD4+Foxp3+ T expressas em CD44, 80% das quais também expressas em CD62L (Fig. 1D, painel médio, muito à direita). Estes dados mostram que 20% das células CD4+Foxp3+ T são efetoras e 80% são fenótipos de memória. Uma tendência fenotípica semelhante foi detectada para as células CD8+Foxp3+ T, mostrando 100% CD44+ dos quais 67% eram células CD62L+ T (Fig. 1D, Painel inferior, à direita). Estes resultados mostram que 33% das células T CD8+Foxp3+ são efetoras e 67% são fenótipos de memória. Dados apresentados em figos. 1A-D sugere que o aumento da expressão de FoxP3high nas células T efetoras foi devido à diferenciação celular em vez da proliferação celular, porque a percentagem relativa de células T efetoras CD44+CD62L diminuiu após a ativação B/I. Mecanismo semelhante pode existir em células T de memória por causa da expressão de FoxP3high após a ativação em comparação com FoxP3low no dia 0.

a Ativação induzida por expressão de FoxP3 em células T CD4+ falha ao transmitir função reguladora in vitro

T, as células foram marcadas com CFSE e estimulado com anti-CD3 (1 ug/ml) e anti-CD28 (1 ug/ml) Abs na presença ou ausência do B/I-ativado CD4+CD25+FoxP3+ células T (2:1 e 20:1 respondente:picos de taxas) por 3 dias. A análise da citometria de fluxo mostrou taxas semelhantes de proliferação de células T CD8+ gated na ausência ou presença de células T FoxP3+ indutíveis (Fig. 2A, 60% vs. 61% e 65%). A ativação CD3 / CD28 também induziu a expressão FoxP3 nas células T CD4+ respondedores. As células T CD4+FpxP3+ Gated também mostraram proliferação de 70-75% após a ativação (Fig. 2A). A análise da apoptose das células T revelou taxas semelhantes de apoptose nas células T respondedoras na ausência ou presença de células CD4+FoxP3+ T (Fig. 2B, 57% vs. 57 e 59%). A maioria das células T CD4+FoxP3+ activadas por B/I (74-76%) foi apoptótica durante a activação anti-CD3/CD28 em co-cultura com células T respondedoras.

Alogênico de ativação de células T durante a MLR induz a expressão de Foxp3 em CD4+CD25+ células T associado com efetoras de memória/fenótipo

realizou-se um 8-dia allogenic MLR para determinar se a indução da expressão de Foxp3 em células T foi estável durante MLR e se tal induzida Foxp3+ expressão podem inibir a proliferação de células T. As células respondedoras e estimuladoras foram obtidas de diferentes doadores saudáveis. As células estimuladoras foram irradiadas (5000 rad) e cultivadas com células respondedoras durante 8 dias na presença de BrdU de 10 µM (BD Pharmingen). As células foram então manchadas com Abs relevantes e submetidas a análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 3A (Painel superior) 86% das células CD4+CD25+ T e 93% das células CD8+CD25+ T mostraram incorporação de BrdU como resultado da proliferação celular. Não foi detectada proliferação apenas nas células respondedoras ou estimuladoras (dados não apresentados). Tal proliferação alogénica ocorreu na presença de uma expressão Foxp3 induzida pela activação nas células T CD4+, de tal forma que 8% das células T CD4+ eram CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, Painel inferior). As células T CD8+CD25+, por outro lado, não mostraram expressão estável da Foxp3. Estes resultados são consistentes com a nossa observação na Fig. 1 mostrando que a expressão da Foxp3 nas células T CD4+ é mais estável do que a das células T CD8+ 6-8 dias após a ativação das células T. Em relatórios anteriores, foram realizados ensaios supressivos in vitro na presença de rácios elevados de células CD4+CD25+ T (Tregs) para células respondedoras, para determinar a função supressiva na activação e proliferação das células T. Tais aumentos artificiais na razão entre as células CD4+CD25+ T e as células respondedoras reduziriam a validade in vivo da observação. A frequência das células T CD4+CD25+Foxp3+ induzidas durante a MLR foi de 8%, o que se considera estar dentro da Gama fisiologicamente relevante, tal como relatado por outros grupos . A frequência de Tregs que ocorrem naturalmente no ratinho também está em torno desta faixa, ainda tendo efeitos regulatórios para a inibição da autoimunidade. Se as células CD4+ T com expressão da Foxp3 tivessem qualquer função reguladora, deveriam ter inibido a proliferação celular durante a cultura in vitro. Semelhante à activação das células T induzida por B/I, os fenótipos das células T num MLR incluíram células T CD44+ efectoras (16%) e CD44+CD62L+ células T de memória (84%) (Fig. 3B). Mais uma vez, todas as células CD4+Foxp3+ T expressaram CD44 entre as quais 90% também expressaram CD62L (Fig. 2B). Estes dados mostram que 10% das células CD4+Foxp3+ T são efetoras e 90% são fenótipos de memória. Uma tendência fenotípica semelhante foi detectada para células CD8+Foxp3+ T, mostrando 100% CD44+ dos quais 76% eram células CD62L+ T. Estes resultados mostram que 24% das células T CD8+Foxp3+ são efetoras e 76% são fenótipos de memória. Falta de função regulatória nestas células T Foxp3+ pode ser por causa de seu fenótipo efetor/memória, uma vez que tem sido relatado que a expressão de Foxp3 nas células T de memória humana resultou em diminuição da atividade supressora . Além disso, células de tipo 1 (Tr1) de Treg conferem função supressora na ausência de expressão FoxP3 . Dado o papel da Foxp3 como regulador mestre do Compromisso e manutenção da linhagem Treg no mouse , não parece ter tal função regulatória bona fide para Compromisso da linhagem Treg em células T humanas.