medicamento Experimental e terapêutico

introdução

asma brônquica é uma doença inflamatória crónica que envolve muitas células inflamatórias e mediadores. T células, particularmente t ajudante (Th)1 e Th2. ter um papel crucial na redução da inflamação das vias aéreas em doentes asmáticos (1). As respostas imunitárias complicadas são capazes de induzir a deficiência de Th1 e a hiperactividade de Th2, o que resulta num desequilíbrio de Th1/Th2. Este desequilíbrio promove a Esecreção de imunoglobulina (Ig)e sensibiliza os mastócitos e eosinófilos através da secreção de fitocina alteradae provoca inflamação alérgica e a capacidade de resposta do respirador (2,3).O interferão (IFN)-γ e a interleucina (IL)-4 são citocinas típicas de 1 e 2, respectivamente.

em doentes com asma, a inflamação persistente ao ar é iniciada pelas células que apresentam antigénios (APC), que integram vários alergénios num sinal para as células T e prime as respostas imunitárias consequentes (4,5).A ativação das células T requer sinais que são iniciados através do complexo de TCR e do aglomerado de diferenciação (CD)28. Dendriticcells maduros (mDCs) expressam altos níveis dos moleculesculescd80 e CD86 Co-estimuladores, que fornecem o sinal que é necessário para ativação, expansão e diferenciação da célula T com CD28 (6). Estudos anteriores demonstraram que os níveis de CD80 e CD86 são elevados nos pacientes com asma (7,8).

em estudos anteriores que investigaram modelos asmáticos, os mDCs demonstraram induzir a polarização de Th2, o aumento da secreção de IL-4, a redução da produção de IFN-γ e induzir ainflamação eosinofílica (9,10). No entanto, não existem estudos que investigem os efeitos da queda do CD80 e do CD86 em DCs sobre a diferenciação da secreção de citocina e da secreção de citocinas pelas células T auxiliares nos modelos de asma dasmurinas.

No presente estudo, co-estimuladoras T-cellactivation sinais foram bloqueados pela supressão de CD80 e CD86molecule expressão em controladores de domínio usando uma pequena interferência de RNA (siRNA), além de efeitos de CD80 e CD86 queda nos níveis de expressão da Th1/Th2 típico de citocinas IFN-γ e IL-4 foram avaliados. Assim, o potencial do CD80 e do CD86 como alvos para a aplicação da interferência da ARNr (RNAi) na determinação terapêutica da asma foi investigado.

materiais e métodos

animais

um total de 20 ratinhos gradeBALB/c saudáveis e isentos de agentes patogénicos específicos (6-8 semanas); peso médio, 18 ± 2 g) foram comprados no centro de animais experimentais da Universidade Sun Yat-Sen(Guangzhou, China). Foram realizadas experiências de acordo com os toprotocolos aprovados pelo Comité de Estudos em animais da Universidade Sun Yat-Senun.modelos para a asma

um total de 20 ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: i) O grupo asmático e ii) o controlo normal group.In o grupo asmático, cada rato foi sensibilizado à ovalbumina(OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitonealmente nos dias 1, 14 e 21 com 100 µg de OVA que foi emulsionado em 20 mg de alum (Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, China). Subsequentemente, os ratos foram expostos a uma exposição aerossol de 5% de óvulos durante 30min/dia em recipientes hermeticamente fechados (com dimensões de 50×50×50 cm) aos dias 28-34. No grupo de controlo normal, os ratinhos foram sensibilizados e pressionados como anteriormente com uma quantidade equivalente de solução salina em vez da solução de proteínas OVA. Às 24 horas após a última injecção, os ratos foram sacrificados por um procedimento de deslocação cervical aprovado, conduzido por pessoal qualificado e totalmente treinado. As amostras foram removidas e fixadas em etanol a 10% durante 24 horas.As amostras foram desidratadas, incorporadas em parafina, e manchadas comhematoxilina e eosina Como anteriormente descrito (11). Mudanças patológicas nos tecidos brônquios e Lung foram avaliadas sob um eclipse Nikon Ti lightmicroscope (Nikon Corporation, Tóquio, Japão).todos os ratinhos foram sacrificados por luxação cervical 24h após o desafio final. A medula óssea foi removida dos fémures e das tíbias com meio de cultura RPMI-1640 (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Após a reconstituição a 250 × g durante 5 minutos, as células foram tratadas com tampão de lise das células vermelhas (RBC) (CWBio Co., Ltd., Pequim,China), lavado com solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugado a 250 × gfor 5 min e cultivado em RPMI-1640 complementado com fator de estimulação de colónias de granulócitos granulocitários recombinantes (rmGM-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, EUA; 10 ng / ml), e rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) foram usados por sua vez. Após 6 dias de cultura, foi adicionado 1 µg/ml de lipopolissacárido (LPS; Sigma-Aldrich) e os mDCs aderentes foram colhidos no dia 7. DCs foram coradas em 4°Cfor 30 min com isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugatedhamster anti-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), ficoeritrina (PE) conjugado de hamster anti-CD80 (5 µg/ml; 12-0801), FITC-conjugatedrat anti-CD86 (5 µg/ml; 11-0862) e PE conjugado de rato anti-majorhistocompatibility complex (MHC) II (5 µg/ml; 12-5322; alleBioscience, Inc., San Diego, CA, EUA) anticorpos monoclonais, e foram subsequentemente analisados por citometria de fluxo (BD FACSVerse; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), a fim de determinar a taxa de expressão positiva da expressão do antigénio rotulado.

siRNA e transfecção

As sequências de siRNA específicas(Quadro I) que visam o CD80 e o CD86 foram concebidas e seleccionadas de acordo com os métodos de Gu et al (12). All siRNA was purchased fromShanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). The transfectionstep was performed according to the manufacturer’s protocol forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Resumidamente, os DCs foram cultivados em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, com uma densidade de 1×105 células/poço no dia anterior à transfecção. Toprepare lipid-siRNA complexes, 3 µl Lipofectamine 2000 wasincubated in 50 µl Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.)à temperatura ambiente, durante 5 minutos, e 12 µl do siRNA indicado foi actualmente combinado com 50 µl de Opti-MEM. The dilutedLipofectamine 2000 and siRNA were subsequently mixed and incubated for a further 20 min at room temperature for complex formation.Posteriormente, o complexo foi incubado com o DCs em 24 wellplate a 37°C em 5% de umidificado de CO2 no ar atmospherefor 6 h. Quando cotransfection foi realizada, quantias equivalentes ofCD80 siRNA:Lipofectamine 2000 e CD86 siRNA:Lipofectamine 2000complexes foram adicionados a cada poço. FAM-scrambled-siRNA foi usado como o controle negativo, a fim de determinar a eficiência da transfecção. Foram criados três grupos de CCD transferidos: no grupo não siRNA, apenas foi acrescentada Lipofectamina 2000, sem que fosse acrescentada qualquer substância ao CCD. No grupo siRNA, os mDCs foram transferidos para o siRNA específico do CD80 e do CD86. No grupo negativesiRNA, os mDCs foram transferidos por não-específicos não-targetingFAM-siRNA, que não tem homologia com os RNAs-alvo.Os experimentos foram realizados em triplicado para cada amostra.A eficiência de transfecção foi determinada usando fluorescencemicroscopia (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) e detectada por citometria de fluxo.

transcrição Reversa-quantitativepolymerase reação em cadeia (RT-de acordo com pcr)

Para avaliar CD80 e CD86 expressão de mRNA de levelsfollowing transfection, RT-de acordo com pcr foi realizada. As sequências de Primer (Quadro II) foram concebidas de acordo com o GenBank e sintetizadas pelo Gene Daan Co., Ltd. de Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, China). A 24 horas após a transfecção, o totalRNA de 1×106 DCs foi extraído utilizando reagente de TRIzol (Invitrogen;Thermo Fisher Scientific, Inc.) and reverse transcribed andamplified using QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH,Hilden, Germany) in a Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics,Basel, Switzerland). As amplificações foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante para o quantitativo SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japão). As condições de amplificação foram de 40 ciclos de 93 ° C durante 3 minutos, 93°C durante 30 segundos, 55°C durante 45 segundos e 72°C para 45sec. cada amostra foi administrada a cada um dos Três Poços. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

citometria de Fluxo

Para detectar a expressão positiva taxas de CD80 andCD86 na DCs seguinte transfection, a citometria de fluxo wasperformed no MHC II/CD11c portão para CD80 e CD86. Seis horas após a transfecção, os CCS foram lavados duas vezes com PBS e incubados com anticorpos fluorescentes a 4°C durante 30 minutos.Subsequentemente, as células foram lavadas novamente com PBS e fixadas com 10 g/l de paraformaldeído. Foram utilizados os seguintes monoclonanticorpos anti-rato:: PE-anti-MHC II,FITC-Anti-CD11c, PE-anti-CD80 e FITC-anti-CD86, como mencionado acima. Todas as análises flowcytométricas foram realizadas usando controles Isotípicos IgG.a separação das células T

Spleens foi removida depois de os ratinhos terem sido eutanasiados por luxação cervical. As células T foram separadas por meio de separação linfocitária da casota, de acordo com o protocolo do fabricante (Dakewe Biotech Co., Ltd., Chino). A densidade celular foi ajustada para 1×109/l antes do processamento posterior.a reacção linfocitária mista (MLR)

os CCS asmáticos derivados da medula óssea de Murino(1×104/bem) e as células T saudáveis (1×105/bem) foram co-cultivadas em placas de 96 poços com uma relação de 1:10. Os sistemas de co-cultura foram divididos em três grupos: i) O grupo não-siRNA, ii) o grupo siRNA, ediii) o grupo siRNA negativo, com DCs dos grupos correspondentes, como descrito acima. Em seguida, os óvulos foram adicionados a cada poço a uma concentração final de 10 mg/l num volume total de 200 µl. As câmaras foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 humidificado durante 72 horas.após 3 dias de co-cultura, o sobrenadante foi recolhido. Os níveis IFN-γ e IL-4 foram analisados utilizando o kitsspecific ELISA para o IFN-γ e o IL-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) de acordo com as instruções do fabricante. Os valores de absorvância foram lidos a 450 nm usando um Mk3 Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

análise estatística

análises estatísticas foram realizadas com SPSSsoftware, versão 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Os dados são apresentados como a média ± desvio-padrão (DP). Os exames foram realizados em triplicado para cada rato. A comparação estatística entre grupos foi realizada utilizando uma análise de Sentido Único da variância,e as comparações dentro de um grupo foram realizadas utilizando o primeiro teste do Estudante. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando P <0,05.

resultados

modelo asmático

os 20 ratinhos saudáveis BALB / c de grau SPF foram atribuídos a grupos de controlo asmáticos e normais, com 10 ratinhos em cada um. A Allmice foi avaliada na análise final sem perda animal experimental. De acordo com a patologia do tecido pulmonar, as secções pulmonares dos ratinhos imunizados pelo OVA revelaram inflamação clara das vias aéreas com infiltrações peribronquiolares e perivasculares. Estas infiltratesconsistiram predominantemente de eosinófilos e linfócitos, e as secções mostraram mucosa brônquica e espessamento do músculo liso,aumento da secreção do muco, queda de células epiteliais nas vias aéreas, estenose de ar e células inflamatórias espalhadas no lunginterstítio. Não foram observadas alterações patológicas significativas nas secções de alga do grupo de controlo normal. Os dados representativosistopatológicos são apresentados na Fig.1.os níveis de expressão de CD11c, CD80 e CD86 nas superfícies themDC foram detectados por triagem celular activada por fluorescência(FACS). mDCs do asmáticos grupo expressou CD11c em um levelcomparable com que o grupo de controlo normal; não significantdifference foi encontrada entre os dois grupos (P>0.05). No entanto, em comparação com o grupo de controlo normal, o grupo asmático mostrou níveis de expressão de CD80 e CD86 significativamente mais elevados(P<0,05; Fig. 2).os projectos siRNA específicos do CD80 e do CD86 foram com êxito transferidos para os mDCs. Os mDCs transfectados foram observados sob um microscópio de fluorescência 6 h após a transfecção.A eficiência de transfecção de siRNA detectada pela FACS foi de ~75% (Fig. 3).os níveis de mRNA e de expressão proteica de CD80 e CD86 nos mDCs transfectados foram detectados por RT-qPCR e FACSanalysis a 24 e 72 h, respectivamente, após transfecção. O CD80and CD86 níveis de expressão de mRNA detectado por RT-de acordo com pcr indicado thatCD80 níveis de expressão do mRNA da não-siRNA, siRNA e negativesiRNA grupos foram 2.09±0.46, de 0,60±0.17, e de 2,04±0.93,respectivamente, e o CD86 níveis de expressão de mRNA foram de 3,58±0.20,de 0,91±0.48, e 2.83±0.83, respectivamente. Os dados fornecidos pelo FACSindicated que o CD80 proteína expressão positiva de taxas de thenon-siRNA, siRNA e negativos siRNA grupos foram 82.45±15.80,30.79±7.07 e 81.83±de 10,07%, respectivamente, e o CD86 proteinpositive expressão taxas foram 89.45±10.22, 27.29±6.99, and87.66±11.74%, respectivamente. O nível de expressão mRNA e as taxas de expressão proteinpositiva exibiram resultados comparáveis. Não houve significância significativa entre o grupo não-siRNA e o grupo siRNA entãoegativo (P>0,05). A expressão CD80 e CD86 nos níveis de ARNm e proteínas no grupo siRNA diminuiu significativamente em comparação com a dos grupos siRNA não-siRNA e siRNA negativo(P<0,05; figos. 4 e 5). Isto demonstra que ainterferência alvo do siRNA pode suprimir significativamente os níveis de expressão do mRNA e do mRNA CD86 e do propetein CD80 e CD86.após 72 h de co-cultura, foram detectados níveis de IFN-γ e IL-4 no sobrenadante do sistema de co-cultura mDC e T-cell pelo ELISA. IFN-γ expressão foi significativamente maior no grupo siRNA (132.73±25.04 pg/ml), quando comparado com thenon-siRNA e negativos siRNA grupos (72.56±26.30 e 80.21±24.42 pg/ml, respectivamente; P<0,05), enquanto que no significativas differenceswere detectada entre o não-siRNA e negativos siRNA grupos(P>0.05). A IL-4 níveis de expressão foram significativamente reduzido no grupo siRNA (93.04±23.13 pg/ml), quando comparado com o não-siRNAand negativo siRNA grupos (150.69±29.50 e 163.19±25.36 pg/ml,respectivamente; P<0,05), enquanto que não houve diferenças significativas weredetected entre o não-siRNA e negativos siRNA grupos(P>0.05; Fig. 6).

discussão

a asma brônquica é uma doença inflamatória crónica que envolve uma variedade de células inflamatórias, incluindo mastcélulas, eosinófilos, linfócitos e outros componentes celulares (14-17).O desequilíbrio entre o Th1 e o Th2 é um factor-chave que contribui para a gravidade da asma(18). Os CCP,incluindo os CCD, os macrófagos e as células B (19), desempenham um papel crucial na estimulação das células T (3). Entre eles, a DC é a mais powerfulAPC, contribuindo para respostas imunitárias primárias e secundárias, incluindo imunidade alérgica. DCs maduros (mDCs) com altos níveis de expressão das moléculas Co-estimuladoras CD80 e CD86 podem ativar as células T, enquanto as células dendríticas imaturas (iDCs) com um baixo nível de expressão de CD80 e CD86 suprimem a resposta das células T e induzem tolerância imunitária (20,21). Os doentes com asma com DCsin demonstraram ser hiperactivos (22).

CD80 e CD86 são dois tipos de proteínas que são expressas na superfície da APC, e que trabalham em conjunto para fornecer os sinais ecoestimulatórios necessários para a ativação da célula-T e para o svival. Estudos anteriores demonstraram que os níveis de expressão das moléculas Co-estimuladoras CD80 e CD86 na superfície mDC estão estreitamente associados à reacção das células Th2 e à inflamação das vias aéreas(23,24). Em doentes asmáticos,os mDCs que expressam fortemente o CD80 e o CD86 podem estimular a activação sem experiência prévia das células T auxiliares do CD4+para se diferenciarem em relação às células Th2, resultando num desequilíbrio Th1/Th2. Depois disso, a inadequação da citoquinas Th1, tais como IFN-γ, juntamente com a crescente secreção de citoquinas Th2, tais como IL-4 e IL-5, provoca inflamação eosinofílica e inflamação alérgica das vias aéreas(10,24,25). São necessários dois pesos e duas medidas para a promoção da activação das células Th2(26-28). O primeiro sinal é a formação de complexos Antigen-MHC na superfície mDC que se ligam especificamente com o complexo receptor-CD3 do receptor das células T em superfícies das células T,e o segundo sinal é a expressão da molécula co-estimulante e a ativação funcional nas superfícies mDC que se ligam especificamente aos recetores nas células T. os dois sinais formam uma via co-estimuladora (29). Também foi sugerido que existe um terceiro sinal (30), uma vez que certas moléculas celulares produzidas por DCs, como a linfopoietina estromática tímica (TSLP), afectam a orientação da diferenciação das células-T. No entanto, entre todos os sinais atrás mencionados, o caminho co-estimulante CD80/CD86-CD28 é o mais clássico e importante. Estudos anteriores indicaram que a via co-estimulante CD80/CD86-CD28 pode ser um objectivo eficaz para o tratamento da asma, demonstrando que o bloqueio da via co-estimulante CD80/CD86 através de uma abordagem de anticorpos monoclonais pode inibir a inflamação em ratinhos asmáticos (25). Além disso, suprimindo a via CD80/CD86co-estimulante utilizando oligonucleótidos anti-condensados hipersupressão da hiperactividade das vias aéreas (31).

RNAi é um fenómeno de silenciamento genético em que as RNAs de cadeia dupla específica, endogéneas ou exógenas, desencadeiam a degradação do ARNm homólogo e induzem a perda de fenótipos funcionais correspondentes. Desde que a técnica foi descoberta pela primeira vez em 1998 por Fire et al (32), a tecnologia foi submetida a um maior desenvolvimento para atingir um elevado grau de especificidade e eficiência. A aplicação terapêutica da tecnologia Rnait é um tema que tem atraído elevados níveis de interesse na investigação médica e clínica básica nos últimos anos.A capacidade da RNAi para inibir a expressão virulenta do gene tem sido amplamente utilizada para tratar uma variedade de doenças (33-35).Além disso, vários estudos relataram que RNAi pode ser usado inDCs para diagnosticar e tratar asma brônquica (36-39).Darcan-Nicolaisen et al (40)descobriu que os dois principais sinais de asma alérgica em theOVA a asma induzida pelo modelo de rato, que são a inflamação das vias aéreas andhyperactivity, foram significativamente melhorados por sinal transducerand ativador de transcrição de 6 (STAT6) silenciando em airwayepithelial células usando a administração de siRNA nariz cai.Moriwaki et al (41) demonstraram que o silenciamento do gene 3(SOCS3) mediado por siRNA poderia suprimir a reactividade das vias aéreas e a infiltração esinofílica induzida pela alergenicstimulação em ratinhos asmáticos. Zheng et al (42) concluiu que a aplicação de siRNA era capaz de inibir a expressão do gene da proteína tirosina cinase (TPK) nos DCs de ratos asmáticos, reprimindo a capacidade funcional dosdcs como células apresentadoras de antigénios, inibindo assim a actividade e diferenciação das células-T. No entanto, não existem estudos sobre os efeitos da redução CD80 e CD86 mediada por siRNA em CD sobre a differenciação das células T em ratinhos asmáticos. No presente estudo, o mRNA e a expressão proteica CD80 e CD86 no DCs derivado de murine bonemarrow foram diminuídos com sucesso com o siRNA alvo CD80 – andCD86, que verificou a eficiência do RNAi.no presente estudo, foi utilizado um modelo de rato asmático que foi estabelecido de acordo com métodos previamente notificados(43). Os resultados indicaram que os mDCs obtidos do grupo asmático exibiam níveis de expressão CD80 e CD86 aumentados, o que implica que a capacidade CD80/Cd86 pode ser aumentada em pacientes asmáticos. Followingtransfection de mDCs com CD80 e CD86-alvo siRNA, themRNA níveis de expressão e de proteína expressão positiva taxas de ofCD80 e CD86 foram significativamente reduzido, confirmando theinhibitory efeito que o siRNA abordagem tinha no co-stimulatorymolecules CD80 e CD86 na transcrição e translationallevels. No sobrenadante da co-cultura das células mDCs e T,A RNAi induziu um aumento na expressão IFN-γ e uma redução dos níveis de IL-4, indicando que a diminuição da expressão das moléculas estimuladoras CD80 e CD86 nos mDCs enfraqueceu a via co-estimuladora dcd80/CD86-CD28 nos ratos asmáticos. O RNAi também afetou a expressão das citocinas Th1/Th2, indicando que o desequilíbrio theoriginal Th1 / Th2 foi alterado e, consequentemente, a imunetolerância foi induzida. Estes achados indicam que o CD80 e o Cd86 podem ser alvos potenciais para a aplicação RNAi no tratamento da asma,e fornecer uma nova via para a terapia genética da asma.

agradecimentos

Este estudo foi apoiado por uma subvenção aberta de Projectos do principal laboratório estatal de doenças respiratórias (Guangzhou,China) (subvenção n. º 2007DA80154F1107).

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