4.3 BBB-travessia bsAbs projetado com um único domínio anticorpos
sdAbs são pequenos (15 kDa), monoméricos antigen-ligação de fragmentos de anticorpos que proporcionam diversas vantagens em relação a outros fragmentos de anticorpos, como “blocos de construção” para bsAbs. Eles ocorrem na natureza como a porção de ligação antigênica de anticorpos pesados em espécies camelídeas (chamados VHH) e peixes cartilaginosos (chamados VNAR) ou podem ser gerados a partir de IgGs convencionais através da obtenção ou engenharia de domínios monoméricos, estáveis VH ou VL (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). os sdAbs são altamente estáveis e compactos e podem acessar epítopos recessos em proteínas, tais como cavidades de receptores ou os locais ativos de enzimas, que são muitas vezes “ocultos” de IgGs convencionais e podem alcançar afinidades de ligação alvo comparáveis às dos anticorpos convencionais (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Estas unidades monoméricas de ligação do antigénio não fazem par com cadeias de luz, o que as torna excelentes blocos de construção para bsAbs heterodimerizados, uma vez que evitam dificuldades de emparelhamento inadequado da Corrente de luz (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Bsab heterodimérico pode ser criado com um ou ambos os “braços” sendo sdAb, este último sendo semelhante em estrutura a anticorpos de cadeia pesada camelídeo (Fig. 3E). a sdAbs também pode ser usada em várias fusões mono, bi ou tetravalentes com anticorpos terapêuticos convencionais ou Fabs (Fig. 3E), geralmente resultando em moléculas menores e menos complexas, em comparação com as geradas com scFvs ou Fabs como blocos de construção, que tendem a ser biofisicamente bem comportados e fáceis de produzir (Holliger & Hudson, 2005). Humanização de VHHs, bem como engenharia de sdAbs é bem descrita, permitindo facilmente gerar sdAbs humanos(izados) com afinidade de alvo ideal e propriedades biofísicas excepcionais (Vincke et al., 2009).
Para avaliar o potencial de uso do camelid VHH FC5 como um BBB transportadora dentro bispecific CNS-segmentação de anticorpos, monovalentes e bivalentes fusões (N – e C-terminal) da FC5 com humanos Fc foram concebidos e avaliados in vitro e in vivo (Farrington et al., 2014). Afinidade de ligação aparente (Kdapp) ao rato BEC da fusão fc5fc bivalente foi de 75 nM, enquanto a ligação fc5fc monovalente estava na gama micromolar. As análises de aparente transmigração taxas (Papp) através de uma in vitro BBB modelo aparente do CNS exposição derivada do soro/CSF farmacocinética do administrado sistemicamente anticorpo construções, e farmacológicos respostas eliciadas por quimicamente conjugated BBB-impermeável neuroativos peptídeos na Hargreaves dor modelo, desde que a prova de reforço do BBB de transporte de grande porte (75 kDa) moléculas de anticorpos mediada por FC5: (1) in vitro Papp valores foram ~ 200 cm/min para ambos os mono e bivalentes N-terminal Fc fusão das moléculas (FC5Fc) comparado com 4-8 cm/min, para controle VHH A20.1FC ou EG2Fc; (2) a exposição aparente ao SNC da fusão FC5Fc foi 30 vezes superior em comparação com o modelo de dor inflamatória do domínio de controlo-FC; (3) a potência farmacológica sistémica dos conjugados FC5Fc com neuropeptídeos dalargina ou galanina em Hargreaves foi 60 vezes superior em comparação com conjugados neuropeptídicos monoméricos FC5. Este resultado foi atribuído à longa semi-vida circulatória (~ 96 h) do FC5Fc em comparação com os conjugados neuropeptídicos FC5; (4) vários conjugados neuropeptídicos VHH–Fc de controlo não mostraram eficácia sistémica.; (5) a fusão do FC5 com o terminal C do Fc resultou numa capacidade atenuada de passagem do BBB. Em contraste, a taxa de fecundidade-segmentação BBB-portador de anticorpos, tanto mono e bivalentes FC5Fc fusão de proteínas mostrou uma taxa similar de transcytosis in vitro, semelhante plasma/CSF perfis farmacocinéticos e similares sistêmica potência na farmacodinâmica modelo in vivo, apesar da aparente afinidade de ligação e valency (Farrington et al., 2014). Estes estudos demonstraram que o BBB-travessia de um único domínio de anticorpos FC5 pode ser usado como uma plataforma BBB transportadora em ambos, heterodimerized “meia-anticorpos” e como o mais facilmente escalável, bi ou tetravalente fusão convencional IgGs (Farrington et al., 2014).outra vantagem potencial dos VHS como portadores de BBB é a sua resistência natural a desafios biofísicos extremos, como temperatura e pH, bem como à degradação da protease (Kim et al., 2014), muitas vezes encontrado em vários compartimentos endocíticos durante a transcitose. Ambas as FC5 e fc5fc são internalizadas em BEC via vesículas revestidas de clatrina, e são classificadas como endossomas iniciais. Curiosamente, verificou-se também que o FC5 estimula a disseminação de microvesículos extracelulares (exossomas) de BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) em que tanto FC5 e níveis aumentados de seu receptor putativo Cdc50A foram detectados pela Western blot e espectrometria de massa alvo. Este estudo sugeriu que exossomas shed podem ser a vesícula final da via RMT libertada da superfície abluminal transportando o complexo receptor-anticorpo (esquematicamente mostrado na Fig. 4). A via RMT e a formação exosome compartilham algumas semelhanças notáveis. Conforme descrito na primeira descoberta de exosomes, um anti-taxa de fecundidade de anticorpos foi controlado por microscopia eletrônica em reticulocytes (Théry, de 2011) da superfície das células, em clathrin-coated pits, dentro de início de endossomas, na superfície interna das vesículas de multivesicular endossomas e, finalmente, na liberado exosomes depois da fusão da multivesicular endossomas com a membrana plasmática (Fig. 4). O RMT parece desenrolar-se de forma semelhante e os microvesicles extracelulares BEC demonstraram conter vários receptores conhecidos por transportarem macromoléculas através do BBB através do RMT, incluindo o TfR, o LRPs, o LDLR e o IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).a partir dos estudos descritos, deve ser evidente que o braço portador de BBB de BSAB alvo do SNC requer uma optimização cuidadosa para cada receptor RMT. Considerações importantes na concepção de bsAbs alvo do SNC são discutidas abaixo, tendo em vista as” lições aprendidas ” do desenvolvimento do Bsab TfR-BACE1 e do nosso próprio trabalho com o FC5 como um anticorpo portador do BBB.