9 O Papel das Proteínas no Spliceosomal Catalítico Core
Comparar o tamanho dos snRNAs com muito maior grupo II íntrons levanta a possibilidade de que várias grupo II intron domínios podem ter sido substituídos por proteínas na spliceosomes durante a evolução, dando origem à moderna ribonucleoprotein (RNP) eucarióticas emenda de máquinas. Embora ainda não exista correspondência de um-para-um, é facilmente possível identificar proteínas espliceossómicas que desempenham uma função mediada por elementos de ARN nos intrões do grupo II. Por exemplo, uma série de proteínas associadas a U2 funcionam iniciando e estabilizando a interação do local de ramificação de U2 snRNA (Fig. 6.3).5,85 nos introns do grupo II, O equivalente U2 (parte do domínio VI) é covalentemente ligado ao site do ramo através de um laço de gancho hiperestável em um arranjo que garante a formação e estabilidade de sua interação (Fig. 6.2). A partir desta perspectiva evolutiva, não é surpreendente que uma grande fração de proteínas spliceosômicas diretamente associem-se a um snRNA, muitas vezes assistindo-o em sua função.5,85 no entanto, muitas proteínas spliceosomais estão envolvidas no desempenho de funções regulatórias não necessárias no contexto de um intrão auto-splicing e são susceptíveis de ser adições mais recentes ao complemento proteico spliceosomal.como mencionado acima, acredita-se que o último ancestral comum dos eucariontes tinha um spliceosoma altamente evoluído e totalmente funcional que se assemelhava aos encontrados nos eucariontes modernos.1,2 embora este spliceosome provavelmente continha significativamente menos componentes em comparação com o menor dos spliceosomas modernos, dados indicam que a maioria dos componentes chave estavam presentes nas primeiras versões dos spliceosomas.1-4 De fato, um subconjunto do proteoma spliceosômico que inclui proteínas associadas ao núcleo catalítico mostra um nível significativo de conservação entre diferentes espécies eucarióticas, com um número de proteínas spliceosômicas sendo uma das proteínas celulares mais conservadas.85,86
Como mencionado acima, muitas ribozimas bem caracterizadas estão associadas com proteínas in vivo que melhoram sua atividade catalítica por vários mecanismos conhecidos.83 estas incluem a estabilização da estrutura funcional das RNAs, a assistência na ligação e posicionamento dos substratos e a assistência na ligação de iões metálicos funcionalmente importantes. No entanto, até à data, não foi observada participação directa na catálise de nenhuma das proteínas associadas à ribozima estudadas.83,87 se se assume que o spliceosoma é uma enzima RNA, os snRNAs spliceosomais são ribozimas incomuns em muitos aspectos. Talvez mais importante, eles são invulgarmente pequenos para uma ribozima catalisando clivagem de ligação fosfodiester através da ativação de um nucleófilo não-comportável. Outras ribozimas naturais catalisando tais reações, nomeadamente introns de grupo I e II e RNase P, são pelo menos duas vezes mais longas do que o comprimento combinado de U6 e u2 snRNAs humanos. Estas ribozimas também são muito maiores do que as ribozimas nucleolíticas que ativam um nucleófilo 2′-hidroxilo adjacente para clivagem de ligação fosfodiéster.Acredita-se que o tamanho maior permite que estas ribozimas se dobrem em estruturas complexas estabilizadas por múltiplas interações terciárias, que por sua vez lhes permitem criar locais ativos sofisticados capazes de posicionar com precisão o local de clivagem, os íons metálicos ativos e o nucleófilo remoto para ataque nucleofílico em linha. É concebível que o U6 e o U2 snRNAs, devido ao seu curto comprimento, formem, na melhor das hipóteses, uma ribozima de splicing ineficiente que requer outros factores spliceosómicos para um posicionamento estável dos elementos activos do local e dos grupos reagentes.
Prp8, que é a proteína spliceosomal mais conservada, é pensado para desempenhar tal papel no site ativo spliceosomal. Prp8 é indiscutivelmente o mais interessante das proteínas spliceosômicas, uma vez que é excepcionalmente conservado com 61% de identidade entre levedura e humana.86 no entanto, ele tem poucos motivos funcionais claramente distinguíveis em seu comprimento de aminoácidos ~ 2300, e os domínios funcionais que foram discernidos até agora são degenerados e provavelmente desempenham funções não relacionadas com o papel celular do motivo fundador original.86 por outro lado, o Prp8 desempenha claramente um papel muito crítico no site ativo spliceosomal. Ele foi cruzado para os sites de splice 5′ e 3′ e o site de ramificação de premessenger RNAs, além de U5 e U6 snRNAs, o que indica que ele está presente no núcleo catalítico spliceosomal e contata diretamente os jogadores críticos na reação de splicing.86,90 além disso, foi demonstrado que o Prp8 interage com várias proteínas espliceossómicas chave, incluindo o Snu114 e o Brr2 (ver abaixo).86,91,92
Mutações no Prp8 estão associados a um amplo espectro de spliceosomal defeitos, incluindo alterações na capacidade de spliceosomes para rejeitar subótima de splice sites e supressão de defeitos causados por mutações em outros spliceosomal fatores, tais como Prp28, Brr2, U4 e U6 snRNAs.86,93,94 um subconjunto de mutantes Prp8 modula seletivamente a eficiência do primeiro ou segundo passo de splicing, especialmente em substratos suboptimais.58,86,95–97 Estas observações são melhor explicadas por uma hipótese afirmando que Prp8 está envolvido na estabilização de alternativas, mutuamente exclusivas ativos site conformações que estão prontos para a catálise da primeira ou da segunda etapa do processo de splicing, e que certas Prp8 mutantes podem levar a seletiva hyperstabilization de um desses estados.58,96,98 embora evidências significativas sugiram que o Prp8 está provavelmente envolvido no posicionamento dos substratos e na estabilização do local ativo, não existem atualmente evidências diretas que sugiram ou refutem seu envolvimento adicional na coordenação de íons metálicos ou participação direta na catálise spliceossômica.
esta incerteza decorre do facto de muito pouco se saber sobre a forma como o Prp8 desempenha a sua função. Um inovador transposon-mediada de triagem de ensaio indicado que grandes regiões do Prp8 são altamente sensíveis a inserção de transposons e susceptíveis de funcionar como uma única unidade estrutural, embora não foi possível inserir transposons ou até mesmo dividir Prp8 em dois fragmentos em uma série de outros cargos, sem perda de viabilidade.90,92 aparte de um sinal de localização Nuclear degenerado perto de seu terminal N e um motivo RRM degenerado (RNA recognition motif) no meio da proteína, apenas dois outros domínios funcionais foram identificados nesta proteína ~ 2300 aminoácido-longa.86
Um degenerado variante do MPN/Jab1 de domínio que está associado com deubiquitinating enzimas é encontrado perto do C terminus de Prp8.86 Análise de alta resolução da estrutura de um fragmento de Prp8 contendo este domínio tem mostrado que o íon do metal-binding site do isopeptidase center é prejudicada, e, portanto, é provável que não funciona como um deubiquitinating enzima.99 100 In vitro, um fragmento de Prp8 contendo este domínio pode ligar-se directamente à ubiquitina com uma afinidade comparável a outras proteínas de ligação à ubiquitina conhecidas.Várias mutações Prp8 conhecidas que interromperam o splicing também interromperam a ligação ubiquitina in vitro, aumentando assim a possibilidade de um papel funcional para a ubiquitinação na regulação do splicing. Importante, proteômica, as análises indicaram que vários spliceosomal fatores, incluindo Sad1, Snu114, Rse1, e Prp8 em si, são ubiquitinated in vivo, e, além disso, o spliceosomal núcleo de proteína Prp19 exposições E3 hidrolase ligase atividade in vitro.101-105 além disso, a ubiquitina desempenha um papel na formação e manutenção do tri-snRNP, possivelmente modulando a regulação mediada pelo Prp8 da função Brr2.102 alternativamente, também é possível que o domínio MMPN/Jab1 funcione como uma plataforma de interação proteína-proteína. Uma série de mutações no Prp8 que caem neste domínio resultam na retinite da cegueira hereditária pigmentosa,86 e estas mutações enfraqueceram a interacção do Prp8 com o Brr2 e o Snu114.99
a estrutura de alta resolução de outro fragmento do Prp8 foi determinada que abrange uma região altamente conservada (69% de identidade de aminoácidos entre leveduras e humanos) localizada perto do seu domínio C-terminal. A análise da estrutura revelou a presença de um dedo β-gancho semelhante aos encontrados em proteínas ribossômicas e um domínio degenerado de RNase H-like.106-108 While the overall geometry of the RNase H-like motif at the level of secondary and tertiary structure was well conserved, the primary sequence showed a much lower level of conservation and only one of the three catalytic residues is present at the active site. O resíduo conservado, um aspartato, está envolvido na coordenação de dois íons catalíticos de metal no local ativo de domínios canônicos RNase H. Num estudo, a mutação deste resíduo no Prp8 na levedura não resultou em nenhum defeito de crescimento detectável, o que poderia indicar redundância ou falta de uma função crítica.Num outro estudo, o seu efeito não pôde ser examinado uma vez que a mutação induziu uma má distribuição do fragmento proteico.107 Não foi observada qualquer ligação de iões metálicos pela região correspondente ao local activo do domínio RNase H quando os cristais foram cultivados em até 200 mM MgCl2, indicando que o local activo degenerado carece de capacidade de ligação de iões metálicos. Além disso, o fragmento de Prp8 contendo este domínio mostrou uma capacidade muito fraca de ligação ao ARN, com um Kd de 20 µM a mais de 200 µM, dependendo da espécie de ARN testada.106-108 embora o fragmento mostrou uma afinidade muito baixa para a ligação RNAs, ele mostrou uma preferência para a ligação duplex RNAs contendo junções de quatro vias.108 in activated human spliceosomes, U2 and U6 snRNAs are predicted to form such a structure.53,69 o que tornou este domínio semelhante a RNase h particularmente interessante foi que os aminoácidos correspondentes ao seu local ativo são posicionados adjacente a resíduos no Prp8 que foram previamente mostrados para cruzar o local de 5′ em spliceossomas pré-atalíticos.109 no entanto, a eficiência da formação desta ligação cruzada foi reduzida à medida que os spliceossomas pré-atalíticos progrediam para se tornarem complexos spliceossómicos cataliticamente activos.A diminuição observada na eficiência da ligação cruzada pode ser interpretada para indicar que esta interacção é interrompida nos spliceossomas activados. Em alternativa, a interacção pode persistir, mas a formação da própria ligação cruzada é abolida devido a uma pequena alteração no ambiente dos resíduos interligados. Se este domínio degenerado de RNase h for posicionado na proximidade do local de 5 ‘ splice em spliceosomas cataliticamente ativos, é possível que ele possa participar na estabilização da conformação ativa do snRNAs, posicionando os substratos no local ativo, e/ou coordenando íons catalíticos de metal. Embora o domínio por si só não possa ligar RNA ou íons metálicos, é possível que na presença de outros elementos activos do sítio possa fazer parte do substrato ou bolsas de ligação de iões metálicos. Apesar destas intrigantes possibilidades, o papel do Prp8 na catálise spliceosómica permanece incerto.