- Abstract
- 1. Introdução
- 2.1. Foram obtidos animais jovens, adultos e velhos ratos machos C57BL/6 com 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses do centro Experimental Animal da Universidade Central do Sul. Os animais eram livres para comer e beber, mantidos a uma temperatura de 25 ± 1°C, e alojados com um círculo luz-escuro de 12:12 h para simular o ritmo circadiano do animal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e para reduzir o número de animais utilizados. Todos os procedimentos experimentais em animais seguiram um protocolo aprovado pelo Comité de Ética para a experimentação em animais da Central South University Animal Care and Use Committee, China. 2, 2. Culturas celulares
- 2, 3. O ensaio de coloração da imunofluorescência
- 2, 4. Blot Ocidental
- 2, 5. A reação quantitativa (em tempo Real) em cadeia da polimerase (PCR em tempo Real)
- 2, 6. Análises estatísticas
- 3. Resultados
- 3.1. A distribuição de astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP, e S100ß em diferentes regiões cerebrais
- 3, 2. As morfologias dos astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP e S100ß em diferentes regiões cerebrais
- 3, 3. O Colocalization de NDRG2, GFAP, e S100ß dentro de Astrócitos em Diferentes Regiões Cerebrais
- 3, 4. A Expressão de NDRG2, GFAP, e S100ß Proteínas em Diferentes Regiões Cerebrais
- 4. Discussão
- disponibilidade de dados
- divulgação
- conflitos de interesses
- as contribuições dos autores
- Agradecimentos
Abstract
astrócitos possuem características morfológicas diferentes dependendo da região cerebral em que são encontrados. No entanto, nenhum dos marcadores astrocíticos atuais pode rotular todas as subpopulações com sucesso. Assim, é fundamental identificar o marcador adequado para uma investigação científica específica. Aqui, comparamos a distribuição e a expressão proteica de três marcadores astrocíticos: NDRG2, GFAP, and S100ß, in the cortex, hippocampus, and thalamus. Os astrócitos NDRG2 e S100ß-positivos distribuíram-se mais uniformemente do que os astrócitos GFAP-positivos em todo o cérebro. As imunoreactividades NDRG2 e S100ß foram as mais fortes no córtex dorsal e tálamo, enquanto a imunoreactividade GFAP foi a mais forte no hipocampo. Além disso, os níveis de expressão proteica de NDRG2, GFAP e S100ß em ratos adultos foram os mais altos no córtex, hipocampo e tálamo, respectivamente. Nós também detectado astrocyte morfologia e descobriu que, no corpo caloso e pedúnculo cerebral, GFAP positivas de astrócitos foram encontrados com mais numerosos e mais processos do que NDRG2 – e S100ß-positivo astrócitos. Estes resultados demonstram que NDRG2 e S100ß são mais adequadamente usados para visualizar a distribuição geral e alterações no número de astrócitos, bem como rotular astrócitos no córtex e tálamo. GFAP, entretanto, é mais apropriadamente usado para rotular astrócitos no corpo caloso, pedúnculo cerebral e hipocampo. Estes resultados ajudam a orientar os investigadores na escolha do marcador astrocítico adequado e sugerem diferenças nas qualidades imunológicas dos astrocitos com base no tecido em que são encontrados.
1. Introdução
astrócitos têm sido considerados células auxiliares que fornecem apenas suporte trófico, metabólico e estrutural aos neurônios . No entanto, nos últimos anos, pesquisas extensas têm mostrado que eles desempenham papéis cruciais em funções fisiológicas e patológicas cerebrais. Astrócitos ajudam na manutenção da homeostase iônica e barreiras hemocerebrais, formação sinapse, e remoção, bem como controlar o fluxo sanguíneo cerebral e regular a reciclagem de neurotransmissores, excitotoxicidade glutamato, e estresse antioxidante . Mais importante, astrócitos possuem morfologia, população e diversidades funcionais em diferentes regiões cerebrais . Por conseguinte, a identificação do marcador mais adequado para os subgrupos polimórficos e múltiplos de astrócitos é fundamental para a investigação sobre a multifunções astrocíticas.
Glial fibrillary acidic protein (GFAP) é o mais comumente usado astrocíticos marcador, mas, como o maior intermédio de filamentos de compor citoesqueleto, GFAP immunolabeled apenas cerca de 15% do total astrocyte volume , e mais de 40% de astrócitos foram encontrados para ser GFAP-negativos no adulto hipocampo de ratos . Adicionalmente, os astrócitos humanos protoplásmicos rotulados pela GFAP foram mal expressos no final do desenvolvimento de astrócitos fibrosos .outro marcador astrocítico comumente usado é S100ß, um peptídeo de ligação Ca2+ abundante no citoplasma, e núcleo de astrócitos que está envolvido na regulação do ciclo celular e modificação do citoesqueleto . No entanto, S100ß também é expresso em uma subpopulação de oligodendrócitos maduros, nas células epiteliais do plexo coróide, e em alguns neurônios . As deficiências de GFAP e S100ß na rotulagem de astrócitos podem levar a imprecisões ou mesmo erros na exploração das funções de astrócitos.
N-Myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2) foi descoberto pela primeira vez em uma biblioteca cDNA cerebral normal por um método de hibridação subtridação subtritiva baseado em PCR . É um gene supressor de tumor e relacionado ao estresse celular associado com a proliferação celular e diferenciação . NDRG2 é amplamente expresso no córtex cerebral, bulbo olfativo, midcerebral, hipocampo e tálamo . Mais importante, o NDRG2 é especificamente expresso em astrócitos do cérebro . Assim, NDRG2 é considerado como um novo Marcador astrocítico, especialmente para astrocitos maduros, não reativos e não proliferativos . No entanto, não foi relatado se o NDRG2 é mais confiável do que o GFAP e o S100ß como um marcador astrocítico, bem como as diferenças de sua distribuição e expressão em diferentes regiões cerebrais.
no estudo actual, comparámos a distribuição, a expressão proteica e a colocalização mútua dos marcadores astrocíticos NDRG2, GFAP e S100ß em todo o cérebro dos ratinhos. Procurámos identificar o marcador mais adequado para astrócitos em diferentes regiões cerebrais.2. Materiais e métodos
2.1. Foram obtidos animais jovens, adultos e velhos ratos machos C57BL/6 com 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses do centro Experimental Animal da Universidade Central do Sul. Os animais eram livres para comer e beber, mantidos a uma temperatura de 25 ± 1°C, e alojados com um círculo luz-escuro de 12:12 h para simular o ritmo circadiano do animal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e para reduzir o número de animais utilizados. Todos os procedimentos experimentais em animais seguiram um protocolo aprovado pelo Comité de Ética para a experimentação em animais da Central South University Animal Care and Use Committee, China.
2, 2. Culturas celulares
as células HT22 (uma linha de células neuronais) e as células MA1800-57 (uma linha de células astrocíticas) foram cultivadas no meio da Águia modificada de Dulbecco (DMEM, Hiclone) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco), 50 U/mL de penicilina e 50 µg/mL de estreptomicina. As células OLN-93 (uma linhagem de células oligodendrogliais) foram mantidas em DMEM suplementadas com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 50 U/mL de penicilina e 50 µg/mL de estreptomicina. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa mistura de 95% de ar atmosférico e 5% de CO2. As células HT22, OLN-93 e MA1800-57 foram semeadas em lâminas e foram manchadas com anticorpos contra a proteína 2 (MAP2), α-tubulina e GFAP, respectivamente.
2, 3. O ensaio de coloração da imunofluorescência
após os ratinhos terem sido anestesiados com pentobarbital de sódio (50 mg/kg), os seus cerebros foram extraídos e fixados com solução salina heparinizada a 0, 9% a frio e com 4% de paraformaldeído. Após a pós-mistura, os cerebros foram sucessivamente desidratados em 20% de sacarose e 30% de soluções de sacarose. Foram preparadas secções de 10 µm de espessura utilizando um cortador Leica CM1900 congelado. As secções cerebrais foram incubadas em 1% H2O2 durante 15 minutos e 0, 3% Triton X-100 durante 15 minutos, com 3×lavagens em PBS apósincubação entre cada tratamento. As secções foram então bloqueado em 5% normal de cabra soro por 1 h em temperatura ambiente e incubadas overnight a 4°C, em uma caixa de umidificação com anticorpos primários da seguinte forma: mouse anti-GFAP anticorpo (#3670, 1:500, Sinalização Celular e Tecnologia), de coelho anti-NDRG2 de anticorpos (#5667, 1:200, Célula de Tecnologia de Sinalização); mouse anti-NDRG2 de anticorpos (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); coelho anti-S100ß de anticorpos (#2017-1, 1:500, Epitomics); mouse anti-Glutamina Sintetase (GS) anticorpo (#MAB302, 1:200, Millipore); coelho anti-MAP2 de anticorpos (#ab32454, 1:500, Abcam); e mouse anti-α-tubulina anticorpo (#T6199, 1:500, Sigma). Em seguida, as seções foram incubadas com misturas de anticorpos secundários Alexa-488 (verde, Invitrogen) e Alexa-647 (vermelho, Invitrogen) conjugados de burro anti-coelho ou burro anti-rato para 2 h no escuro à temperatura ambiente. 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) foi usado para manchar núcleos. As secções foram montadas com 50% de glicerol. Finalmente, as seções foram vistas e fotografadas usando um microscópio de fluorescência do Olimpo Bx51 (Japão). Os anticorpos usados em nosso estudo foram amplamente utilizados em nossos estudos anteriores e por outros investigadores , e a sensibilidade e especificidade destes anticorpos foram confirmadas.
2, 4. Blot Ocidental
o córtex, hipocampo e tálamo foram coletados de ratos C57BL/6 com 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. As amostras foram homogeneizadas em tampão RIPA, e a concentração das amostras de proteínas foi medida pelo Kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Biotechnology, EUA). As amostras de proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, China) e eletricamente transferidas para membranas de Difluoreto de polivinilideno (PVDF). Os componentes do kit de gel SDS-PAGE incluíam um tampão de Gel de 30% Acr-Bis, Tampão de gel de separação SDS-PAGE, Tampão de gel de empilhamento SDS-PAGE, EPS (Persulfato de amónio) e TEMED (N, N, n’, n’-tetrametiletilenodiamina). Subsequentemente, as membranas foram bloqueadas em 5% de leite seco sem gordura diluído em TBST (TBS com 0, 05% Tween 20) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com anticorpos primários específicos: anticorpo anti-GFAP do rato (#3670, 1:1000, Sinalização Celular e Tecnologia), de coelho anti-NDRG2 de anticorpos (#5667, 1:1000, na Sinalização Celular e Tecnologia), de coelho anti-S100ß de anticorpos (#2017-1, 1:1000, Epitomics); e de coelho anti-GAPDH de anticorpos (#5174, 1:1000, na Sinalização Celular Tecnologia) durante a noite a 4°C. As membranas foram, então, incubadas com uma SOLUÇÃO secundário conjugado anti-coelho ou anti-mouse de anticorpos (Thermo Scientific, EUA) por 2 h. Quimioluminescente sinais foram desenvolvidos usando Ocidental Relâmpago Quimioluminescência Reagente Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) e detectado por um analisador de imagem LI-COR Odyssey System (Biotecnologia LI-COR, EUA). A imunoreactividade das bandas de proteínas foi analisada quantitativamente pela Bio-Rad® Image Lab™ software. Os valores de densidade da banda foram normalizados para GAPDH.
2, 5. A reação quantitativa (em tempo Real) em cadeia da polimerase (PCR em tempo Real)
o córtex, hipocampo e tálamo foram coletados de ratos C57BL/6 com 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses. O RNA Total foi isolado utilizando um Kit de Transzol Up mais ARN (código No. ER501-01, Transgénero, China) e quantificado utilizando um NanoDrop 2000. Em seguida, 1000 ng de RNA total foi transcrito ao contrário em uma reação de 20 µL a 42 ° C durante 15 minutos, seguido de 85°C para 5 segundos usando um Supermix de síntese cDNA de primeira cadeia TransScript® All-In-One para qPCR (código No. AT341, Transgen, China). Os componentes do kit incluído um 5×TransScript® All-in-One SuperMix de acordo com pcr (TransScript® RT, Inibidor de RNase, Ancorado Oligo(dT)18 Primer, Random Primer(N9), dNTPs, tampão), um 5×TransScript® All-in-One Não-RT Controle SuperMix de acordo com pcr, um Removedor de gDNA e uma RNase-free água. O Supermix de controlo no-RT de 5×TransScript® All-In-One para qPCR foi utilizado como um controlo negativo. A PCR em tempo Real foi realizada numa reacção de 20 µL, de acordo com o manual do fabricante para a extremidade TransStart Verde qRNA SuperMix (código no. Aq141, Transgen, China). As sequências de primer do ARNm utilizadas podem ser encontradas na Tabela 1. A reação foi realizada a 94 ° C por 30 segundos, seguida por 40 ciclos de 94 ° C por 5 segundos, 60°C por 15 segundos, e 72°C por 19 segundos no sistema de detecção de PCR ViiA7 em tempo Real (2720 termociclador, biosistemas aplicados). Os iniciadores e sequências derivadas da expressão relativa de mRNA foram analisados usando a fórmula .
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2, 6. Análises estatísticas
testes estatísticos foram realizados usando PRISM v7. 0 software (GraphPad). Comparações entre dois grupos foram realizadas usando os testes t do aluno. Comparações entre vários grupos foram realizadas usando ANOVA de via única com posttest de Tukey. Todos os valores foram apresentados como a média ± DP. Os valores de p<0, 05 foram considerados estatisticamente significativos.
3. Resultados
3.1. A distribuição de astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP, e S100ß em diferentes regiões cerebrais
as regiões dos ratos cerebra foram identificadas pela rotulagem dos núcleos celulares. Além disso, um atlas cerebral correspondente do mouse foi usado para verificar as regiões específicas analisadas (Figura 1). Nós então usamos a coloração da imunofluorescência para detectar a distribuição de astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP, e S100ß em diferentes regiões cerebrais de ratos machos adultos com 6 meses de idade. Os astrocitos NDRG2 e S100ß-positivos foram mais abundantes e mais uniformemente distribuídos do que os astrocitos GFAP-positivos em todo o cérebro (Figura 2). NDRG2-positivo astrócitos foram concentrados na face dorsal do córtex (Região 1) e o tálamo (Região 5), mas um pouco menos no hipocampo (Região 4), corpo caloso (Região 3) e ventral córtex (Região 2) e o menor no pedúnculo cerebral (Região 6) (Figuras 2(a) e 2(b)). Astrócitos GFAP positivos concentraram-se mais no hipocampo; menos foram detectados no corpo caloso e pedúnculo cerebral e quase indetectáveis no córtex dorsal, córtex ventral e tálamo (Figuras 2(a) e 2(c)). Os astrocitos s100ß-positivos concentraram-se principalmente no córtex dorsal e no tálamo, menos no hipocampo e no córtex ventral, e menos ainda no pedúnculo cerebral e no corpo caloso [Figuras 2 (b) e 2(c)]. A distribuição dos astrocitos NDRG2 positivos foi semelhante à dos astrocitos s100ß-positivos.
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astrócitos em diferentes regiões cerebrais apresentaram imunoreactividades desiguais a NDRG2, GFAP e S100ß (Figura 2). Astrócitos no córtex dorsal e tálamo reagiram fortemente a NDRG2, e S100ß, mas fracamente a GFAP. Astrócitos no hipocampo reagiram fortemente à GFAP e moderadamente a NDRG2 e S100ß. Astrócitos no córtex ventral, corpus calosum e pedúnculo cerebral reagiram fracamente a moderadamente a NDRG2, GFAP e S100ß (Tabela 2).
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+++: extremamente positivo; ++: moderadamente positiva; +: fracamente positiva.
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A distribuição de astrócitos rotulado por NDRG2, GFAP, e S100ß em diferentes regiões cerebrais de ratos machos foi semelhante ao do antigo ratos machos (12 meses) (Figura 3).
3, 2. As morfologias dos astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP e S100ß em diferentes regiões cerebrais
astrócitos são divididos principalmente em dois tipos: astrócitos fibrosos em matéria branca e astrócitos protoplásmicos em matéria cinzenta. Portanto, comparamos as morfologias dos dois tipos rotulados por marcadores diferentes no corpo caloso (matéria branca, Região 3) e no hipocampo (matéria cinzenta, Região 4) (Figura 4). Os resultados de ratos machos adultos (6 meses) mostraram que os astrócitos NDRG2 e s100ß – positivos apresentaram uma forma Estelada caracterizada por soma grande e redonda, juntamente com processos citoplásmicos curtos e grosseiros que tinham poucos ramos. Os astrócitos GFAP positivos apresentam uma forma radial caracterizada por pequenos soma, longos processos e multibranches (Figura 4). Além disso, no corpus calosum e no pedúnculo cerebral, os astrócitos rotulados pela GFAP apresentavam processos mais longos e abundantes do que os rotulados por NDRG2 e S100ß (figuras 5 e 7).
3, 3. O Colocalization de NDRG2, GFAP, e S100ß dentro de Astrócitos em Diferentes Regiões Cerebrais
NDRG2 foi quase colocalized com GFAP em astrócitos de ventral córtex, corpo caloso, e pedúnculo cerebral e, principalmente, colocalized com GFAP em astrócitos de hipocampo (Figuras 5 e 8(a)). NDRG2 não teve quase nenhuma colocalização com GFAP em astrócitos do córtex dorsal e tálamo (Figura 5). NDRG2 e S100ß apresentaram colocalização quase completa em astrócitos das seis regiões cerebrais (figuras 6 e 8(b)). GFAP e S100ß apresentaram uma significativa colocalização em astrócitos do córtex ventral, corpus calosum e pedúnculo cerebral e quase completa colocalização em astrócitos do hipocampo (Figura 7). GFAP e S100ß não tinham quase nenhuma colocalização em astrócitos do córtex dorsal e tálamo (Figura 7).
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também detectámos a colocalização de NDRG2 e de outro fabricante astrocítico, glutamina sintetase (GS), em astrocitos do cérebro do Ratinho. O NDRG2 e o GS tinham uma coloração significativa nos astrocitos (figura s1a). NDRG2 e GS apresentaram uma completa colocalização em astrócitos fibrosos do corpo caloso e em astrócitos protoplásmicos do hipocampo (figura s1b). Foram também detectadas expressões proteicas NDRG2 na linha neuronal das células HT22, na linha oligodendroglial das células OLN-93 e na linha astrocítica das células MA1800-57 (figura s2). A proteína NDRG2 foi detectada nas células MA1800-57 e foi apenas detectada nas células HT22 e OLN-93 (figuras s2a e s2b).
3, 4. A Expressão de NDRG2, GFAP, e S100ß Proteínas em Diferentes Regiões Cerebrais
Nós utilizado western blotting para detectar os níveis de expressão de NDRG2, GFAP e S100ß proteínas em três regiões cerebrais de adultos de ratos machos (6 meses): o córtex, hipocampo e tálamo (Figura 8 (c)). Analisamos os níveis de expressão destes marcadores na mesma região cerebral(Figura 8 (d)). No córtex, o nível de NDRG2 expressão foi muito superior ao que GFAP e S100ß níveis de expressão (p<0.001, p<0.05). O nível de expressão de S100ß também foi muito maior que GFAP (p<0,05). No hipocampo, o nível de expressão GFAP era maior que NDRG2 e S100ß (p<0.01), e o nível de expressão NDRG2 foi um pouco menor que o nível de expressão S100ß, embora a diferença não foi estatisticamente significativa. No tálamo, o nível de expressão de S100ß foi significativamente superior aos níveis de expressão GFAP e NDRG2 (p<0,01), enquanto o nível de expressão NDRG2 foi semelhante ao da GFAP.a seguir, analisamos os níveis de expressão do mesmo marcador em diferentes regiões cerebrais (Figura 8(e)). O nível de expressão NDRG2 no córtex foi muito maior do que no hipocampo e tálamo (p<0,01), e não foi observada diferença significativa entre o hipocampo e o tálamo. O nível de expressão de GFAP no hipocampo foi o maior entre as três regiões (p<0.001, p<0.01); nenhuma diferença significativa foi observada entre o córtex e tálamo. O nível de expressão S100ß no tálamo foi significativamente maior do que no córtex e hipocampo (p<0.01), sem diferença significativa observada entre os dois últimos.
Nós também detectados os níveis de proteína de NDRG2, GFAP, e S100ß no córtex, hipocampo e tálamo de ratos machos com idade entre 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses (Figuras 9(a)-9(f)). Os níveis de proteína de NDRG2 e GFAP no córtex, hipocampo e tálamo gradualmente aumentou com a idade (p<0.05, p<0.01). Os níveis proteicos de S100ß no córtex e tálamo, mas não no hipocampo, aumentaram gradualmente com a idade (p<0.05, p<0.01, p<0.001). Os níveis de mRNA de NDRG2, GFAP, e S100ß no córtex, hipocampo, tálamo de ratos machos com idade entre 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses foram consistentes com aqueles dos níveis de proteína (p<0.05, p<0.01, Figuras 9(g)-9(i)).
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4. Discussão
neste estudo encontrou-se que os astrócitos rotulado por NDRG2 e S100ß foram distribuídos mais amplamente e de modo uniforme do que aqueles rotulados por GFAP em todo o cérebro de jovens, maduros e velhos ratos. Isto sugere que NDGR2 e S100ß são marcadores mais apropriados para observar a distribuição geral e as alterações no número de astrócitos. Além disso, nossos resultados mostraram que os astrócitos em diferentes regiões cerebrais, apresentam diferentes níveis de imunorreatividade para NDRG2, GFAP, e S100ß, o que sugere que, no córtex e tálamo, NDRG2 e S100ß são mais apropriados astrocíticos marcadores de GFAP. A imunoreactividade inigualável dos astrócitos a NDRG2, GFAP e S100ß pode também dever-se à sensibilidade e especificidade dos anticorpos que usamos. Além disso, as morfologias dos astrócitos rotulados por NDRG2 e S100ß eram semelhantes umas às outras, mas eram obviamente distintas das rotuladas por GFAP porque estes marcadores rotulavam diferentes estruturas citoesqueléticas. O NDRG2 mancha o citoplasma e as membranas celulares e mancha fracamente o núcleo . GFAP mancha principalmente o soma e processos, mas não o núcleo, enquanto S100ß mancha o núcleo e parte do citoplasma e processos . Comparando as morfologias dos astrócitos rotulados por NDRG2, GFAP e S100ß, descobrimos que GFAP era um marcador mais adequado para astrócitos no corpo caloso, pedúnculo cerebral, e especialmente o hipocampo. As proteínas NDRG2 e S100ß foram expressas mais no córtex e tálamo, respectivamente. Nós inferimos que NDRG2 é mais adequado para astrócitos no córtex, enquanto S100ß é mais adequado para astrócitos no tálamo quando quantificar densidade astrocítica. Os diferentes padrões de expressão proteica de NDRG2, GFAP e S100ß no córtex, hipocampo e tálamo confirmaram a heterogeneidade funcional astrocítica.
os Astrócitos foram encontrados para jogar um papel importante na manutenção da homeostase, e participam ativamente em quase todos os distúrbios neurológicos, tais como avcs isquêmicos, traumáticas, lesões cerebrais, doença de Alzheimer e doença de Parkinson . It has been demonstrated that astrocytic morphology, gene expression, and function differed among different regions of the cerebrum . Astrocitos fibrosos e astrocitos protoplásmicos são duas subpopulações principais identificadas pela sua morfologia . Astrócitos fibrosos têm processos longos e finos, e uma aparência de estrela, enquanto os protoplásmicos têm inúmeros processos finos, que CONTATO e bainha sinapses . Curiosamente, muitos genes são heterogeneamente expressos por subconjuntos de astrócitos. Estes genes codificam proteínas tais como transportadores de glutamato e canais iónicos , bem como receptores de glutamato , dopamina e opióides .
a heterogeneidade da expressão genética implicava a diversidade funcional dos astrócitos. Por exemplo, a ingestão de glutamato difere entre os diferentes subconjuntos . Adicionalmente, as oscilações espontâneas de cálcio diferem entre diferentes camadas do córtex somatossensorial. A camada Cortical 1 astrocytes mostrou atividade assíncrona assíncrona Ca2+, enquanto a camada 2/3 astrocytes mostrou pouca atividade síncrona Ca2+. No córtex, os astrócitos respondem ao glutamato e norepinefrina com aumentos de cálcio, enquanto os astrócitos hipocampos apresentam respostas de cálcio a ATP, GABA, glutamato, acetilcolina, prostaglandinas e endocanabinóides . Estudos também mostraram que astrócitos cultos de diferentes regiões do cérebro têm diferentes capacidades para estimular o crescimento neurótico e ramificar . Como os astrócitos em diferentes regiões cerebrais apresentam características diferentes de morfologia e função, identificar o marcador mais apropriado para astrócitos em diferentes regiões cerebrais é crucial para pesquisadores astrocíticos.apesar de várias proteínas terem sido relatadas como expressas selectivamente por astrócitos, nenhuma demonstrou ser inteiramente restrita a todos os subtipos astrocíticos. GFAP, o marcador astrocítico mais usado, é preferencialmente expresso em astrocitos de matéria branca sobre os de matéria cinzenta e não consegue rotular todos os processos de astrocitos . Mais importante, existem subconjuntos de astrocitos GFAP-negativos que apresentam correntes K+ dependentes de voltagem, enquanto os astrocitos GFAP-positivos apresentam o padrão clássico de correntes independentes de tempo e voltagem .
estudos anteriores descobriram que o S100ß era capaz de rotular astrócitos tanto na matéria cinzenta quanto na branca; no entanto, também foi expresso em alguns oligodendrócitos e neurônios . Verificou-se que o S100ß é mais expresso em astrócitos do tálamo, um subtipo de células que participam na limpeza de detritos Daérgicos produzidos pela degeneração de terminais Daérgicos na doença de Parkinson, facilitando a presença de lisossomas e a formação de autofagossomas . A análise transcriptômica de astrócitos identificou a família aldeído desidrogenase 1, membro L1 (ALDH1L1), como um marcador astrocítico . No entanto, ALDH1L1 também rotulou oligodendrocitos . Da mesma forma, os transportadores excitatórios de aminoácidos glutamato/transportador de aspartato (GLAST), glutamina sintetase (GS), glutamato transportador-1(GLT-1), vimentina, connexin 43, aquaporina 4, e a glicoproteína CD44 da superfície celular também tiveram limitações ao etiquetar astrocitos .
NDRG2 é especificamente expresso em astrócitos de ratos e ratinhos e está associado ao crescimento e maturação do cérebro embrionário em desenvolvimento . Além da proliferação celular, diferenciação e transporte transmembranar, NDRG2 também participa em Respostas ao estresse, depressão, doenças isquêmicas e distúrbios neurodegenerativos . Em ratos e seres humanos, NDRG2 participa do desenvolvimento do déficit de atenção / transtorno de hiperatividade (TDAH), uma doença associada com o centro de locomoção no córtex cerebral . Flugge et al. detectou a expressão de NDRG2 nos cerebros de humanos, marmosets, musaranhos, ratos e ratinhos, e sugeriu que NDRG2 era um novo Marcador astrocítico, especialmente para astrocitos maduros, não reativos e não proliferativos . Neste estudo, nós detectado pela primeira vez o padrão de distribuição de NDRG2-positivo astrócitos em diferentes regiões cerebrais e diferenças com os astrócitos rotulado pelo clássico marcadores de GFAP e S100ß.astrócitos e marcadores astrocíticos mudaram durante o envelhecimento normal do cérebro. Trabalhos anteriores mostraram que astrócitos são ativados no início do envelhecimento, e o aumento significativo de astrócitos GFAP positivos foi encontrado nas regiões hipocampos de ratos idosos . Os níveis de proteína GFAP e mRNA GFAP aumentaram em várias partes do cérebro envelhecido, como o córtex cerebral, hipocampo e cerebelo . Discrepâncias permanecem entre vários relatos de S100ß no cérebro envelhecido . Cada vez mais, estudos têm mostrado que o NDRG2 está associado a doenças relacionadas com a idade, como a doença de Alzheimer. No nosso estudo, os níveis de mRNA GFAP e NDRG2 no córtex, hipocampo e tálamo gradualmente aumentaram com a idade, enquanto os níveis de mRNA S100ß no hipocampo e tálamo aumentaram com a idade, mas não no córtex.
devemos notar que, atualmente, muitos marcadores além dos que testamos, tais como ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44, e vimentina, são usados para rotular astrocitos. Em nosso estudo, nós apenas comparamos os astrócitos cerebrais clássicos rotulados pelo novo Marcador proposto NDRG2 e os marcadores mais comumente usados: GFAP, S100ß, e GS no cerebrum.
Em conclusão, nosso estudo indica que NDRG2 e S100ß são marcadores mais apropriados para astrócitos no córtex e tálamo, respectivamente, bem como para observar a distribuição geral e alterações no número de astrócitos ao longo do cérebro. Enquanto isso, GFAP é superior a NDRG2 e S100ß quando rotular os processos e ramos de astrócitos no corpo caloso, pedúnculo cerebral, e especialmente o hipocampo. Nosso estudo mostra a importância de escolher o marcador mais apropriado para astrócitos em diferentes regiões cerebrais do mouse, que fornece orientação para pesquisadores de neurociência ao explorar funções astrocíticas.
disponibilidade de dados
os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão incluídos no artigo.
divulgação
Zengli Zhang e Zhi Ma são os co-primeiros autores.
conflitos de interesses
os autores declaram que não têm conflitos de interesses.
as contribuições dos autores
Zengli Zhang e Zhi Ma contribuíram igualmente para este estudo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por Pequim, Natural Science Foundation (nenhuma. 7194321 para Lixia Zhang), o serviço Nacional de Ciências Naturais da Fundação da China (não. 81801138 para Yulong Ma, não. 81771206 para Wangyuan Zou), o Jovem Bolsista de bolsa de Investigação de Chinês Anestesiologista (Associação nenhuma. 21700001 para Yulong Ma), o Miaopu Fundação de Chinês PLA Hospital Geral (não. 18KMM47 to Lixia Zhang), and the Beijing Municipal Science & Technology Commission (no.1811000017180022 to Hang Guo).materiais suplementares Figura 1. A colocalização de NDRG2 e GS dentro de astrocitos. Figura Complementar 2. A expressão da proteína NDRG2 nas linhas celulares. (Matérias suplementares)