DISCUSSÃO
os Nossos resultados mostram que, através de um planejamento cuidadoso, treinamento e padronização de reagentes e protocolos, uma transnacional laboratório de rede tem capacidade para produzir consistentes e comparáveis HAI resultados do ensaio. Os cinco laboratórios de saúde pública e acadêmicos participantes deste estudo faziam parte do PCIRN, que foi desenvolvido para aumentar a capacidade Nacional do Canadá para apoiar vacinas e outras pesquisas sobre a gripe em caso de pandemia. Numa situação de pandemia, com testes de gripe de alto volume, de alta pressão e geograficamente dispersos, a normalização do teste HAI será da maior importância para garantir a comparabilidade dos resultados entre laboratórios. Os laboratórios PCIRN mostraram um alto padrão de reprodutibilidade intralaboratorial, com 99,8% de precisão de duplicados (99.2% a 100% por laboratório), de 97,8% dos títulos dentro de um 2-dobre de alcance sobre o ensaio repetido dias (93.3% a 100% por laboratório), e 91,1% dos soros de teste mostrando título reprodutibilidade sobre cada repetição do seis-protocolo de ensaio (60% a 100% por laboratório). A reprodutibilidade interlaboratorial foi também elevada, com títulos medianos em todas as réplicas provenientes dos quatro laboratórios de não-Referência num intervalo de duas vezes superior ao do laboratório de referência para 100% dos soros testados. Por laboratório, os títulos são de 94,3% e 98.9% das amostras quantificadas numa diluição única do laboratório de referência e dos títulos consensuais, respectivamente (gamas, 85% a 100% e 95% a 100%). Estas percentagens atingem limiares de aceitabilidade típicos para a variabilidade do doseamento por HAI (ou seja, pelo menos 80% das amostras estão dentro de uma diluição dos valores nominais e/ou dos GMTs em todos os ensaios ). A especificidade do doseamento de HAI (100%) e a sensibilidade (87,5% a 100%) nos laboratórios PCIRN estavam igualmente bem dentro dos critérios de aceitação de estudos anteriores (isto é,, 100% das amostras negativas devem quantificar abaixo dos níveis de quantificação e pelo menos 80% das amostras positivas devem quantificar como positivas ).a variabilidade intralaboratorial da doseamento por HAI, a repetibilidade nos laboratórios PCIRN parece semelhante à demonstrada noutros estudos (5, 22). Uma das ressalvas desses estudos anteriores foi que não mais de três repetições foram examinadas, apesar das práticas comuns de validação do teste imunológico de examinar seis ou mais testes repetidos (24-27). Como tal, não é claro se os seus dados são directamente comparáveis aos resultados determinados ao longo de seis ensaios neste estudo. No entanto, a nossa constatação de 0% para 6,7% (mediana, 0%) dos ensaios com resultados diferentes, por mais de 2 vezes de pessoas de outras ensaio repete parecem comparáveis de 4,8% para 7,1% observado anteriormente em um laboratório (22) e a 0% para 15% (mediana, 2%) em nove laboratórios (5).os resultados da elevada reprodutibilidade do título HAI entre os laboratórios PCIRN geograficamente dispersos contrastam com relatórios anteriores que demonstram uma variabilidade substancial entre os laboratórios internacionais que realizam este ensaio (5, 6, 9-12). Por exemplo, dados de um grande estudo colaborativo (11 laboratórios) encontraram GCV por amostra variando de 84% a 803% (média de GCV por vírus de 138%, 155% e 261% ). Outros estudos relataram GCVs para amostras H1N1 e H5N1 que abrangeram 95% a 345% (11) e 22% a 582% (6), e GMTs diferiram entre laboratórios em até 80 vezes (11) ou 128 vezes (9). Embora relatórios anteriores incluíssem frequentemente um maior número de laboratórios participantes do que o estudo atual, mesmo quando apenas seis laboratórios contribuíram com dados, a média interlaboratorial GCV foi de 83% para cinco amostras H1N1, com 80% deles excedendo uma diferença de 4 vezes entre laboratórios (11). Em contraste, o estudo actual mostrou uma média de GCVs por vírus de apenas 39% e 17%, com 95% das amostras numa diferença de 4 vezes entre laboratórios. Uma amostra excedeu a diferença de 4 vezes; o título não foi quantificável para esta amostra num laboratório, pelo que o valor mais baixo foi atribuído em vez de Medido. Se essa amostra fosse omitida das análises, o valor máximo de GCV seria de 75,5%, o que representaria um valor inferior ao mínimo GCV em outros estudos. Embora a amostra mostrasse uma variabilidade mais elevada do que outras, Este baixo intervalo de medição parecia, em geral, menos preciso do que os intervalos mais elevados. Por exemplo, o VGC variou entre 43, 4% e 156, 4% nos títulos entre 10 e 80, em comparação com 11, 1% a 53, 1% nos títulos mais elevados (Fig. 3). Uma maior variabilidade com amostras de título inferior também foi descrita anteriormente (23) e provavelmente contribuiu para classificações de seroprotecção incongruentes no presente estudo para as três amostras H1N1 com títulos mais próximos do limiar de 40 (títulos de consenso de 22, 24 e 43). Apesar disso, a precisão de diagnóstico da seroprotecção nos laboratórios PCIRN manteve-se globalmente elevada (93,6% quando foram utilizados títulos de consenso para definir a seroprotecção e 89,5% em comparação com os valores laboratoriais de referência).o elevado grau de Concordância dos títulos de HAI interlaboratórios nos laboratórios PCIRN pode estar relacionado com a harmonização cuidadosa dos procedimentos de Hai e dos reagentes em toda a PCIRN. Participantes em estudos anteriores que mostraram elevada variabilidade interlaboratorial geralmente usaram métodos de doseamento de HAI que variavam entre laboratórios. As variáveis do doseamento que se pensa contribuírem para a variabilidade dos resultados incluíram a quantidade de vírus adicionada, o sistema de cultura viral (e.g., ovos de galinha embrionados versus cultura de tecidos), a duração do tratamento com RDE, a diluição inicial do soro, o tipo e a idade das RBC utilizadas, e o tempo permitido para a decantação do RBC (5, 11, 12). Surpreendentemente, no entanto, quando Wood et al. desde que participantes de laboratórios comerciais e públicos envolvidos em testes de vacina contra a gripe sazonal na Europa, com um procedimento operacional padrão detalhado a seguir e reagentes/materiais comuns, relataram que a variação interlaboratorial não foi significativamente melhorada (10). Os autores especularam que “variações técnicas locais persistentes”, bem como diferentes fornecedores de RBC, poderiam ter afetado a reprodutibilidade entre laboratórios, mas observaram que uma maior padronização estava além dos limites de viabilidade para seu estudo. Publicações posteriores interpretaram esses achados como indicando que a padronização do teste HAI entre laboratórios não é, em geral, uma abordagem viável para harmonizar os resultados do HAI em diferentes laboratórios (8, 12), e pelo menos um grupo tentou desenvolver um teste hai modificado e mais robusto para gerar dados mais confiáveis e reprodutíveis (22).no estudo em curso, os laboratórios PCIRN respeitaram rigorosamente o protocolo de ensaio hai da Organização Mundial de saúde publicamente disponível, no qual os pontos sujeitos a variações técnicas ou interpretativas foram harmonizados entre laboratórios antes do início do estudo. Os reagentes-chave (por exemplo, RDE, RBC, stocks de vírus) foram obtidos junto dos mesmos fornecedores, tanto quanto possível. Além disso, restringir o teste a um único Tecnólogo em cada local de teste permitiu aumentar a padronização. O possível efeito da utilização de várias pessoas em cada laboratório não foi testado neste estudo. Embora a utilização de múltiplos operadores pudesse potencialmente aumentar a variabilidade, o único estudo que examinou esta possibilidade de realização de testes HAI não revelou qualquer diferença significativa entre os resultados de dois operadores do mesmo laboratório (22).as potenciais variações entre laboratórios nas estirpes virais cultivadas para utilização no ensaio foram minimizadas entre os laboratórios PCIRN através da utilização de existências de sementes virais de uma única fonte que foram cultivadas na mesma linha celular em condições semelhantes em todos os laboratórios. Especula-se que a reprodutibilidade interlaboratorial pode ser passível de melhorias ainda maiores foram os estoques de trabalho virais a serem produzidos centralmente e distribuídos aos laboratórios participantes. A importância das variações da estirpe viral para os títulos do endpoint HAI é bem ilustrada pelos títulos 2 a 3 vezes inferiores demonstrados num estudo quando o ensaio HAI utilizou uma estirpe a/Cal pH1N1 em comparação com o reassortante X179A que ainda possuía hemaglutininas e neuraminidases equivalentes (11). Infelizmente, as existências não foram sequenciadas como parte deste estudo, pelo que não podemos verificar que todos os laboratórios utilizaram vírus com sequências hemaglutininas idênticas. Mesmo que tenham sido introduzidas Pequenas variações de sequência através da propagação local de unidades populacionais de vírus, a variabilidade entre laboratórios neste estudo foi pequena, pelo que é difícil imaginar como a utilização de unidades populacionais com sequências de HA idênticas poderá reduzir ainda mais a variabilidade. Embora as diferenças não tenham excedido o dobro neste pequeno conjunto de amostras, pequenas variações na sequência HA introduzidas pela propagação local das existências virais poderiam ser uma possível explicação para as tendências de subestimação dos títulos H1N1 e sobrestimação dos títulos H3N2.
Vários estudos relataram redução interlaboratorial variabilidade em HAI títulos através de uma calibragem resultados com os padrões internacionais (6, 11-13); no entanto, tais normas não existem para a atual gripe sazonal B e influenza A H3N2 estirpes de vírus, e o constante deriva antigênica das cepas sazonais que a unidade anual de reformulação das vacinas pode requerer o contínuo desenvolvimento e validação de novos padrões. Neste estudo, a comparabilidade interlaboratorial parece superior à obtida através do uso mesmo dos padrões de calibração mais eficazes. Por exemplo, após calibração com IS 09/194, Wood et al. (11) relatou que o máximo de diferenças entre GMTs em diferentes laboratórios reduzida de 80 vezes a 64 vezes (i.é., um valor ainda muito maiores do que o máximo de 11 vezes no estudo atual) e que varia de GCV entre laboratórios diminuiu de 95% para 345% (mediana, 105%) 34% 231% (mediana, de 109%)—por exemplo, bem mais do que o intervalo de 0% a 156% (mediana, 27%) observada neste estudo. Da mesma forma, o uso de substituição é 10/202 diminuiu o GCV entre laboratórios de um intervalo de 108% a 157% para um intervalo de 24% a 144% em cinco amostras e diferenças máximas entre laboratórios de 43-vezes a 21-vezes (13), e, usando o padrão 07/150, Stephenson et al. (6) reduziu a mediana do GCV de 15 amostras de clado 1 de NIBRG-14 H5N1 de 125% (intervalo, 31% a 582%) para 61% (34% a 535%).embora a razão exata para o alto nível de concordância entre os laboratórios PCIRN em comparação com estudos anteriores não possa ser determinada, nosso sucesso foi facilitado pelo incentivo que tivemos como Rede Nacional para trabalhar em direção ao objetivo comum de estabelecer processos reprodutíveis. Processo detalhado e rigoroso e harmonização do reagente entre locais é talvez o único “novo” aspecto que trouxemos para este estudo, em comparação com o corpo de longa data de literatura mostrando fraca reprodutibilidade HAI entre laboratórios. No entanto, os nossos dados sugerem que, com uma normalização cuidadosa, as variações interlaboratoriais dos títulos HAI podem ser reduzidas a níveis semelhantes aos observados em laboratórios individuais. Potencial próximos passos para minimizar as variações na HAI títulos em laboratórios em todo o mundo, seria a mobilização de redes/consórcios, a implementação de orientações e/ou requisitos regulamentares para a utilização de procedimentos padrão e reagentes padronizados de treinamento para garantir a reprodutibilidade e a prestação de apoio e/ou incentivo para os laboratórios para abraçar a “padronização” do conceito.