biotina e seu parceiro de ligação avidin são comumente usados hoje em biologia molecular para uma série de diferentes técnicas e protocolos. Neste post discutiremos o papel natural da biotina, da biotinilação, da descoberta da interacção biotin-avidin e do uso da biotinilação na biologia molecular!
Aprender sobre a vivo biotinylation bacterianas em proteínas de fusão
a Biotina é uma vitamina essencial para a vida
Embora a biotina é mais comumente conhecida por seu papel na biologia molecular, biotina (Vitamina H ou Vitamina B7) é o primeiro de uma coenzima essencial que é exigido por todos os organismos para a vida. A biotina é apenas sintetizada por plantas, a maioria das bactérias e alguns fungos, pelo que os mamíferos devem obter a vitamina através de fontes externas. Os humanos absorvem a maior parte da biotina necessária no intestino delgado da microflora que lá reside.
biotina é um cofactor que, na sua forma activa, está covalentemente ligado ao local activo das principais enzimas metabólicas, incluindo a biotina carboxilase e as descarboxilases. Estas enzimas catalisam a transferência de grupos carboxilo para ácidos orgânicos para produzir metabolitos celulares importantes. A biotina actua como um carboximetil portador de um composto para o outro. Estas enzimas dependentes da biotina são essenciais para processos como a gluconeogénese, a lipogénese, o metabolismo dos aminoácidos e a transdução de energia.a Biotinilação é o processo geral pelo qual a biotina é adicionada a uma proteína ou macromolécula. A biotina pode ser adicionada enzimaticamente ou quimicamente. A biotinilação enzimática ocorre naturalmente nas células e é o processo pelo qual a biotina está ligada covalentemente a uma lisina específica no local ativo de uma enzima recentemente sintetizada. A ligase proteica da biotina (BPL) é responsável por esta modificação proteica pós-translacional altamente específica. A maioria dos organismos tem menos de cinco enzimas em todo o proteoma que são biotiniladas. Em E. coli, por exemplo, a BPL, BirA, é responsável pela biotinilação de apenas uma lisina em todo o organismo na proteína carboximetilamortante da biotina (BCCP).
a Descoberta da biotina-avidin interação
No final da década de 1930, observou-se que os animais alimentados com uma dieta principalmente de ovos brancos gostaria de desenvolver lesões de pele e outras terríveis problemas de saúde. Esta doença foi denominada “lesão da clara do ovo” e foi determinada como sendo devido a uma deficiência na vitamina H, mais tarde renomeada vitamina B7/biotina. A lesão da clara de ovo iria afligir estes animais, mesmo que a sua dieta estivesse a ser suplementada com biotina. Assim, algo no ovo branco estava sequestrando biotina de ser absorvida. Em 1940 Esmond E. Snell foi capaz de purificar a proteína responsável pela ligação da biotina, avidin. Avidin foi apropriadamente nomeado para a galinha, “Avian”, ovo que foi purificado. Snell confirmou mais tarde que avidin era, de facto, o culpado da lesão da cor branca de ovo por alimentar ratos com avidin purificada (Kresege et al., 2004). Avidina é uma glicoproteína que consiste em quatro subunidades idênticas que podem ligar uma molécula de biotina.a biotina e a avidina têm uma afinidade extremamente forte entre si. Na verdade, a ligação entre eles é uma das mais fortes interações proteína-ligando não-covalente encontradas na natureza. Uma vez formada a ligação não é afetada por alterações no pH, temperatura ou solventes orgânicos.
os usos da biotina em biologia molecular
biotina é uma molécula relativamente pequena e solúvel em água que não interfere com as macromoléculas a que é adicionada. A biotina tem também uma cadeia lateral exposta que pode ser facilmente manipulada para fazer espécies reactivas sem afectar o local de ligação à avidina. Com todas estas características, não é surpreendente que os cientistas tenham começado a explorar a biotina e a sua forte interacção com a avidina para fins de Biologia molecular e Biotecnologia.
Uma vez que um polipeptido é biotinilado (mais sobre este mais abaixo) pode ser incubado ou co-expresso com avidina ou uma proteína estruturalmente semelhante que foi descoberta nos anos 60, a estrepavidina. O complexo Biotin-avidin pode então ser usado e / ou manipulado para o propósito pretendido por um cientista. Dois dos usos mais comuns de biotinilação no laboratório são a purificação de proteínas e experiências de imunoprecipitação. As proteínas ou complexos biotinilados podem ser facilmente purificados utilizando colunas ou esferas revestidas com avidina. a interacção biotin-avidin também foi adaptada para utilização na rotulagem da imunohistoquímica e dos anticorpos. Nestas experiências, a biotina é adicionada a um anticorpo primário ou Secundário que aponta para a sua proteína de interesse ou anticorpo primário, respectivamente. Avidin ligado a um repórter é então adicionado à reação para fácil detecção. Os múltiplos locais de ligação da biotina encontrados na avidin também são ideais para a amplificação do sinal durante estes experimentos. Durante a detecção, pode adicionar-se à sua amostra uma enzima repórter biotinilada que está pré-incubada com avidina livre. Qualquer local livre de ligação à biotina neste complexo pode ligar-se ao seu anticorpo biotinilado. Isso cria uma grande malha de complexos biotin-avidin ligados à sua proteína de interesse levando à amplificação do sinal do repórter e detecção mais fácil. Esta estratégia é referida como o complexo de Avidin-biotina (ABC) imunohistoquímica (IHC). Para mais informações sobre ABC e IHC confira O Guia científico Thermo Fisher.
Existe uma série de outras aplicações de biologia molecular para a biotina e a avidina. Uma breve lista de algumas outras aplicações comuns e links para artigos e páginas web relevantes estão listados abaixo.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of a biotina e a avidina, as macromoléculas de interesse em primeiro lugar devem ser biotiniladas. Os cientistas desenvolveram vários métodos para quimicamente biotinilar macromoléculas de interesse tanto in vitro como in vivo.reagentes de Biotinilação: a cadeia lateral exposta da Biotin pode ser cruzada com grupos funcionais de aminoácidos in vivo através de produtos químicos especializados (reagentes de biotinilação). Há uma variedade de reagentes de biotinilação disponíveis que diferem nos grupos funcionais ou resíduos que eles visam, bem como sua solubilidade, e assim diferentes reagentes são úteis para a biotinilação em diferentes microambientes. Existem também reagentes de biotinilação reversíveis e cliváveis para ajudar com a eluição específica de proteínas biotiniladas. For help determining which biotinylation reagent to use check out Thermo Fisher Scientific’s Biotinylation Reagent Selection Tool.as proteínas podem também ser biotiniladas através da exploração da especificidade da E.coli BPL, BirA. Se Bem te lembras, a BirA biotinilata apenas uma lisina em todo o proteoma E. coli. Usando este conhecimento, os cientistas identificaram a sequência de 13 aminoácidos necessária para o reconhecimento de BirA e biotinilação. Esta sequência de 13 aminoácidos é denominada AviTag. Usando AviTag, pode-se rotular uma proteína de interesse com biotina simplesmente criando uma fusão na qual AviTag é adicionado ao N ou C terminus da proteína. BirA tem sido mostrado para efetivamente biotinilato AviTag expressando proteínas em bactérias, leveduras, insetos e células de mamíferos. Olha A Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.
pode encontrar plasmídeos que contêm AviTag e BirA em Addgene!
oligonucleótidos:
biotina pode ser adicionada a qualquer terminus de uma sequência de ADN durante uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando um primer biotinilado. A biotina também pode ser enzimaticamente incorporada durante a PCR utilizando um dUTP marcado com biotina. Existem vários tipos de rótulos de biotina que podem ser adicionados a um oligonucleótido, dependendo da sua aplicação a jusante. Oligonucleótidos rotulados com biotina podem ser usados em uma infinidade de aplicações, incluindo, mas não limitado a hibridização in situ, blotting (Norte e Sul) e ligação de afinidade.
Fotobiotinilação:
Fotobiotina pode ser usada para rotular ADN e ARN de forma não selectiva. O acetato de fotobiotina consiste numa molécula de biotina ligada a um grupo arilazida fotoreactivo. Sob forte luz visível, o grupo arilazide torna-se reativo e forma uma ligação com ácidos nucleicos próximos (McInnes et al., 1990). A fotobiotinilação é, por vezes, mais fácil e menos dispendiosa do que outros métodos enzimáticos. Cientistas têm comumente usado este método para ligar proteínas ou polipeptídeos a um substrato sólido (Holden e Cremer, 2003).1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E.” Molecular Biology of Biotin Attachment to Proteins; Symposium: Nutrition, Biochemistry and Molecular Biology of Biotin ” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. “The enzymatic biotinylation of proteins: a post-translational modification of exceptional specificity.”Trends in Biochemical Sciences, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.3. Said, H. M. ” Biotin: The forgotten vitamin.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.4. “The Discovery of Avidin by Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” Biotinilação de proteínas de alta capacidade.”Methods Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central PMCID: PMC3223083.6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C.,& Symons, R. H. “Preparation and uses of photobiotin.”Methods in Enzymology 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
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