Sulfato de bactérias redutoras nas fezes humanas e sua associação com doenças inflamatórias intestinais

Characteristics of patients with IBD

Activity of IBD was evaluated on clinical, endoscopic and histological findings.

Characteristics of patients with IBD

Activity of IBD was evaluated on clinical, endoscopic and histological findings.detecção e contagem de SRB uma grama de fezes foi misturada com 4 ml de tampão fosfato salino e centrifugada (3000 rpm, 5 min). Um mililitro de sobrenadante foi inoculado imediatamente num meio líquido (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, França) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o Teste-kits Labège® consistem em frascos contendo 9 ml de um meio específico (compostos orgânicos: lactato e acetato, agente redutor: citrato de titânio) anaeróbica condicionado para SRB detecção. É inoculado com uma seringa através de uma tampa de borracha. Este meio limpido e incolor foi originalmente concebido para a detecção de SRB a partir de amostras ambientais. Foi comparado ao meio sólido e (composto orgânico: lactato, agentes redutores: ácido ascórbico e ácido tioglicólico) , inoculado em paralelo sob atmosfera anaeróbica. Os SRB foram enumerados utilizando tubos longos e estreitos cheios com este último meio e inoculados com diluições decimais das fezes. Todos os meios inoculados foram incubados a 37 ° C durante 2 meses. A presença de SRB foi determinada pela formação de um precipitado negro (sulfeto ferroso) em meios líquidos e pelo aparecimento de colônias negras em meios sólidos.

2.3 Design of PCR primers

The 16S rDNA sequences of Dessulfomonas and Dessulfovibrio strains available in the GenBank database were compared using the Sequence Navigator software, version 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Permitiu a concepção de seis iniciadores para a identificação por PCR do SRB previamente isolado de seres humanos , relacionados, respectivamente, com D. piger (anteriormente Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, e D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 and D. desulfuricans MB were differented as the 16S rDNA sequences of these strains exhibit a difference of 3%. Os primers foram 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Porco-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT gato GATO CCT AC-3′), e P687-R (5′-GAT ATC TAC GGA TTT CAC TCC TAC ACC-3′) (Tabela 2). A especificidade destes iniciadores foi verificada em todas as sequências bacterianas disponíveis no banco de dados GenBank usando o programa Blast, versão 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, EUA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. os dessulfuricanos Essex 6, duas estirpes relacionadas com D. dessulfuricans MB e oito estirpes identificadas como D. fairfieldensis) foram utilizados como controlos positivos. A sensibilidade da PCR foi avaliada com diluições de suspensões de estirpe bacteriana quantificadas. A especificidade da PCR foi verificado com a negativa de controles, incluindo o tipo de cepas (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) e comum intestinal clínica estirpes pertencentes às seguintes espécies: Bacteroides frágil, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniforme, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Bactérias inofensivas, Enterobacter império romano, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium pequeno, Eubacterium pegajoso, Fusobacterium nucleatum, Copenhaga do canal, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus grande, Proteus maravilhoso, Proteus comum, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, e Streptococcus bovis.no final do período de incubação, todos os 151 Kits de teste inoculados Labège® foram verificados utilizando a PCR multiplex. Foram obtidos extractos de ADN de 500 µl de meio de cultura, após centrifugação e ressuspensão em tampão TE (Tris–HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Brevemente, as células foram lisadas utilizando sucessivamente lisozima (3 mg ml−1), SDS (1%, M/v) e proteinase K (0, 25 mg ml−1). Após uma incubação nocturna a 37°C, o ADN foi extraído pelo método padrão fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Cada de 50 µl de PCR mistura continha 5 µl de DNA extração (cerca de 50 ng de DNA) e valores finais de 0,4 µM de cada primer, 0,8 mM de cada deoxynucleoside trifosfato de adenosina (Boehringer Mannheim Bioquímicos, Mannheim, Alemanha), 0,4 mM de Tris–HCl buffer, 1,5 mM de MgCl2, e a 1,5 U de Taq DNA polimerase (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, UK). Todas as reacções foram efectuadas utilizando o sistema PCR Geneamp 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EUA). Uma etapa inicial de desnaturação de 94°C durante 4 minutos foi seguida por 30 ciclos de desnaturação (94°C, 1 min), recozimento (55°C, 1 min) e extensão (72°C, 2 min), e com uma extensão final (72°C, 5 min). Em cada execução foram incluídos controlos negativos (água em vez de extracto de ADN) e positivos (extracto de ADN de D. fairfieldensis). Os produtos amplificados foram resolvidos por electroforese em 1, 5% (M/v) de géis de agarose contendo brometo de etídio (1, 6 mg ml−1). Uma escada de DNA de 100 bp foi usada como marcador de tamanho (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, EUA). D. piger, D. dessulfuricans Essex 6, D. os dessulfuricanos MB e D. fairfieldensis foram identificados por uma banda de 255-, 255-, 396 – e 534-bp, respectivamente. D. piger e D. dessulfuricans Essex 6 foram ainda diferenciados por testes PCR separados utilizando os respectivos iniciadores específicos. Para amostras negativas, foi realizada a amplificação 16s rDNA utilizando os iniciadores consensuais 27f e 1525r para verificar a ausência de inibição das PCRs por contaminantes.

3 resultados

3.1 detecção e contagem de SRB

em indivíduos saudáveis e, de acordo com os critérios acima, SRB foram encontrados em 10 fezes (24%) com ambos Test-kit Labège® e meio de Postgate. Em doentes da unidade Hepato-Gastro-Enterologia, a SRB foi cultivada a partir de 42 fezes utilizando o meio do Postgate. Três amostras adicionais foram consideradas positivas com o teste-kit Labège®. Assim, entre os 110 doentes estudados, a SRB foi detectada por cultura em 45 doentes (41%). Três amostras adicionais deram resultados equívocos com o teste-kit Labège® (presença de um precipitado acastanhado escuro). Os tempos médios de detecção do crescimento do SRB foram de 2 e 6 dias utilizando o teste-kit Labège® (intervalo de 1-11 dias) e o meio do Postgate (intervalo de 3-39 dias), respectivamente. A contagem média de SRB nas fezes de indivíduos saudáveis e doentes foi de 105 g−1 (Intervalo 102-109 g−1). Assim, a contagem de SRB não estava relacionada com o estado clínico dos doentes.a sensibilidade do teste de PCR multiplex foi de 100 bactérias por ml. A sua especificidade foi constatada pela ausência de reacções cruzadas entre as quatro genoespécies diferenciadas. Cada Controlo Positivo foi considerado positivo apenas com o conjunto correspondente de iniciadores. Todas as estirpes utilizadas como controlos negativos para verificar a especificidade, incluindo as estirpes de tipo de D. gigas e D. vulgaris, deram resultados negativos com os quatro conjuntos de iniciadores. A especificidade das reações foi confirmada sequenciando os produtos amplificados. As sequências obtidas sempre corresponderam às esperadas. No caso das amostras SRB-negativas por PCR, a amplificação 16s rDNA permitiu eliminar a possibilidade de inibição das PCRs por contaminantes.produtos PCR multiplexados obtidos com quatro estirpes diferentes de Dessulfovibrio. Faixas: 1 e 7, de 100 bp DNA ladder; 2, controle negativo (água); 3, D. piger (anteriormente Desulfomonas pigra) ATCC 29098T; 4, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T; 5, D. desulfuricans MB ATCC 27774; 6, D. fairfieldensis ATCC 700045.

multiplex PCR produtos obtidos com quatro estirpes diferentes de Dessulfovibrio. Lanes: 1 and 7, 100-bp DNA ladder; 2, negative control (water); 3, D. piger (formerly Dessulfomonas pigra) ATCC 29098T; 4, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T; 5, D. desulfuricans MB ATCC 27774; 6, D. fairfieldensis ATCC 700045.