Investigador Principal: Zuben E. Sauna, Doutorado
Escritório / Divisão / Laboratório: OTAT / DPPT / HB
Geral
Um grande problema com a base de proteínas terapêuticas é a sua imunogenicidade, que é, a sua tendência para provocar uma indesejável resposta imune contra si mesmos. Uma forma de resposta imunitária é a ativação das células B, que produzem anticorpos que se ligam às proteínas e reduzem ou eliminam seus efeitos terapêuticos. Tais anticorpos também podem causar complicações que podem ser potencialmente fatais. Assim, uma parte crítica da determinação da segurança clínica e eficácia dos produtos terapêuticos à base de proteínas é a medição da sua tendência para desencadear a formação de anticorpos.a resposta imunitária à terapêutica à base de proteínas também envolve células-T, que ajudam a ativar as células B para que elas produzam anticorpos, incluindo aqueles que bloqueiam a terapêutica proteica. Isto acontece se a proteína natural produzida pelo organismo for defeituosa de alguma forma. Nesse caso, as células-T respondem a uma proteína terapêutica artificial normal, como se fosse estranha, uma vez que é diferente da proteína natural defeituosa. Uma resposta das células-T como esta às vezes ocorre no caso da proteína FVIII, uma proteína que é fundamental para a capacidade do organismo de formar coágulos sanguíneos para parar o sangramento. Pessoas que não têm quantidades suficientes de FVIII, ou cujo FVIII é defeituoso de alguma forma, sofrem de hemofilia A, uma doença na qual a coagulação do sangue é defeituosa e leva a sangramento excessivo. O problema do FVIII defeituoso é geneticamente baseado. Embora não haja cura para a hemofilia A, a infusão da proteína terapêutica FVIII tem sido um dos exemplos mais bem sucedidos de manejo de uma doença crônica. Infelizmente, o desenvolvimento de anticorpos anti-drogas contra o FVIII infundido é um impedimento significativo a esta estratégia. O tratamento de pacientes que desenvolvem uma resposta imunitária é mais complexo, menos eficaz e excessivamente caro. Parece agora que as variações individuais na tendência para o desenvolvimento de anticorpos anti-drogas também podem ser baseadas em diferenças genéticas. Isto reflecte-se na observação clínica de que as pessoas com hemofilia A de ascendência africana Negra têm duas vezes mais probabilidades do que os doentes de ascendência caucasiana Europeia de produzir anticorpos contra as proteínas de factor VIII administradas como terapêutica de substituição.uma estratégia para prevenir discrepâncias entre FVIII natural e FVIII de substituição é projetar proteínas FVIII geneticamente modificadas para que não desencadeiem reações imunitárias. Mas há tantas diferenças entre os sistemas imunológicos das pessoas que não é provável que os pesquisadores sejam capazes de projetar uma proteína FVIII que é segura para todos eles. Portanto, propomos fazer uma abordagem personalizada para prever–e evitar — respostas imunitárias às proteínas FVIII. Nosso objetivo a longo prazo é desenvolver uma abordagem baseada em genes para identificar indivíduos cujo sistema imunológico é susceptível de reagir a versões específicas de proteínas terapêuticas geneticamente modificadas para que estes pacientes possam ser tratados com versões dessas proteínas que são menos propensos a causar respostas imunitárias.estamos também abordando o problema das diferenças nas estruturas tridimensionais de proteaginosas e proteínas naturais que desencadeiam células B para produzir anticorpos contra proteínas terapêuticas. O método atual para prever se certas partes dessas proteínas desencadearão a formação de anticorpos é desafiador e caro. Portanto, estamos usando pequenos pedaços de moléculas como o DNA chamadas aptâmers para sondar as proteínas e determinar suas formas exatas. Os aptâmeros são feitos de cadeias de moléculas chamadas ácidos nucleicos que se dobram em formas específicas que dependem de quais ácidos nucleicos estão presentes e da ordem em que ocorrem no aptâmero. Assim, ao identificar que aptamer liga-se firmemente a uma parte específica de uma molécula, podemos prever a forma de que parte da molécula, um pouco como prever a forma de um bloqueio por conhecer a forma da chave que se encaixa nela.estamos agora a usar esta técnica para determinar as formas de FVIII e a parte da toxina antraz chamada antigénio Protector. Se um aptâmero perde a sua capacidade de se ligar ao FVIII, por exemplo, isso indicaria que parte desta proteína de coagulação sanguínea mudou de forma, aumentando a probabilidade de que irá desencadear uma reacção imunitária que reduz a sua actividade terapêutica. Estamos a usar esta abordagem para determinar se as proteínas terapêuticas têm formas que desencadeiam a produção de anticorpos. E estamos colaborando com o centro de Avaliação e pesquisa de drogas para adaptar esta tecnologia para analisar novos produtos proteicos desenvolvidos como cópias de medicamentos proteicos existentes e aprovados (biossimilares) para garantir que eles serão seguros e eficazes.
visão geral científica
1) Previsão da interacção dos epítopos das células T com antigénios específicos da classe II da MHC.
Factor VIII (FVIII) é um componente essencial da cascata de coagulação e os indivíduos com deficiência em factores de coagulação apresentam alterações hemorrágicas ao longo da vida. O desenvolvimento de imunogenicidade contra versões terapêuticas (perfundidas) de FVIII é um impedimento significativo para o tratamento bem sucedido de Hemofílicos.cerca de 50% dos casos de hemofilia A são causados por uma inversão dos exons 1-22 do gene F, O que resulta na produção de um polipeptídeo representando esses exons, mas não 23-26. No entanto, há um gene aninhado dentro do promotor F8 que traduz exons 23-26. No entanto, a inversão de 1-22 significa que os peptídeos sobrepostos gerados a partir desta proteína não incluem a junção entre 1-22 e 23-26. Enquanto os peptídeos da proteína FVIII, que cobre esta junção, seriam, portanto, estranhos ao sistema imunológico do paciente, eles não são geralmente imunogênicos. Em vez disso, a imunogenicidade devido às diferenças entre o endógeno e o FVIII infundido é provavelmente devido a uma variedade de fatos, especialmente de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mas também mutações com perda de sentido e deleções e mutações nonsense, bem como inversões,
Portanto, o ideal (mas não provável) solução para a imunogenicidade problema de FVIII infundido seria design FVIII substituições que correspondem a cada paciente haplótipo e HLA tipo para evitar o desencadeamento de uma resposta imune. Ao projetar tais biólogos para corresponder a cada paciente não é prático, pode ser possível em casos em que existem diferenças claras e significativas entre populações específicas (por exemplo, entre as de ascendência europeia caucasiana e negra africana). Nesses casos, seria desejável adaptar os desenhos da FVIII endógena a cada grupo, a fim de assegurar que uma população não receba uma parte desproporcionada dos benefícios de uma única versão da FVIII, enquanto a outra população suporta uma parte desproporcionada dos riscos da mesma FVIII infundida.a tecnologia atual permite a identificação de formações haplotype para FVIII, bem como o desenvolvimento de pelo menos uma gama limitada de produtos farmacêuticos personalizados do fator VIII. Portanto, nosso objetivo de curto prazo é determinar a 1) distribuição quantitativa de diferentes haplotipos (SNPs) em indivíduos de descendência europeia-caucasiana e negra-africana; 2) distribuição de antigénios MHC Classe II nestas populações; 3) Composição de FVIII usado como drogas; e 4) mutação, deleção ou inversão causadora de doenças no gene F8 (FVIII) de pacientes individuais. Utilizaremos estes dados para prever a imunogenicidade dos produtos FVIII individuais em diferentes populações e/ou doentes individuais.
2) Development of aptamers as a tool for the investigation of protein-drug conformational epitopes.Aptâmers, ácidos nucleicos capazes de formar conformações complexas, são ferramentas potenciais para mapear conformação de proteínas, identificação e previsão de locais imunogênicos, e para evitar imunogenicidade. O nosso laboratório está a desenvolver aptâmers de ADN de cadeia única para o Factor VIII recombinante humano.
Nós projetamos uma biblioteca de DNA ingênua para gerar aptamers usando definidas 5’ e 3€™ regiões para PCR flanqueando uma região aleatória de 60 bases. A biblioteca de DNA naÃve foi desnaturada e os segmentos ssDNA foram autorizados a dobrar-se em formas tridimensionais únicas. (The 60 random bases would teoricamente result in 460 unique conformers. Incubamos a piscina de ssDNA dobrada com FVIII e através do SELEX iterativo (evolução sistemática de ligantes por ciclos de enriquecimento exponencial), fomos capazes de selecionar aptâmeros de ligação às proteínas.o nosso laboratório seleccionou uma amostragem de aptamers individuais nos ciclos 3, 5 e 8 e clonou-os e sequenciou-os. Estamos usando estes clones para caracterizar os aptâmeros através da análise da estrutura 3-D prevista, propriedades de ligação, e o efeito na atividade FVIII. Além disso, estamos fazendo comparações silicas destes clones para acompanhar a evolução dos aptamers.
3) utilização de diversas técnicas analíticas para avaliar as características proteicas que podem estar relacionadas com a imunogenicidade.
em colaboração com DRS. Mansur Khan e Rakhi Shah (Divisão de Qualidade do Produto, CDER), vamos analisar interações excipiente medicamentosas usando métodos térmicos (calorimetria diferencial de varrimento, microcalorimetry, análise termogravimétrica), técnicas espectroscópicas (Fourier transform infra-red, perto de infravermelho, Raman), cristalografia (difração de raios X), e ressonância magnética nuclear.
4) caracterização de anticorpos sensíveis à conformação.um método alternativo para estudar epítopos conformacionais de proteínas terapeuticamente importantes é desenvolver e caracterizar anticorpos que são sensíveis a mudanças conformacionais. Em colaboração com o Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) caracterizamos vários anticorpos que são sensíveis à conformação da metaloprotease de zinco ADAMTS13, uma proteína multi-domínio que cliva o fator von Willebrand e está implicada em púrpura trombocitopênica trombótica. Nossos resultados sugerem que esses anticorpos podem ser reagentes úteis para distinguir ADAMTS funcionais e não funcionais 13, e para analisar transições conformacionais durante o ciclo catalítico.
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