Actomiozinei scalează contractilitatea cu alungirea mioblastelor și îmbunătățește diferențierea prin exportul nuclear Yap

Mioblastele adoptă o formă alungită pentru a diferenția și regla rețeaua lor de actină în zona de răspândire

pentru a evalua relația dintre forma celulară, rețeaua de actină și aderențele focale, am cultivat mioblastele C2C12 pe un strat omogen de fibronectină (FN). După 24 de ore în cultură, mioblastele au fost fixate și colorate pentru actină pentru a determina parametrii morfologici ai acestora (Fig. 1A). Substraturile acoperite cu FN au permis stabilirea unor interacțiuni specifice celulă-substrat prin recrutarea integrinelor transmembranare specifice. Într-adevăr, mai multe subunități de integrină de la suta care se combină cu subunitatea de la suta 1 sunt exprimate în timpul miogenezei scheletice, fiind importante în migrarea celulelor miogene, fuziunea mioblastelor,maturarea fibrelor musculare sau în menținerea integrității musculare32, 33. Experimentele suplimentare efectuate pe substraturi acoperite cu laminină (LAM) au indicat că ambii parametri morfologici (indicele formei celulare, perimetrul celular și aria celulară, suplimentar Fig. 1A) și interacțiunile celulă-substrat (numărul și aria aderențelor focale, suplimentar Fig. 1B) au fost similare statistic pe FN și LAM, validând învelișul FN pentru studierea in vitro a morfologiilor mioblastelor C2C12 în timpul procesului de fuziune/diferențiere.

Figura 1

Mioblastele adoptă o formă alungită pentru a diferenția și regla rețeaua lor de actină de zona de răspândire. (A) imagini de epifluorescență codificate în culori ale mioblastelor individuale tipice C2C12 care prezintă diferiți indici de formă celulară (CSI) in vitro. Celulele au fost colorate cu faloidină pentru actină. Barele de scară sunt de 20 de metri cubi. Analiza morfologică a (B) CSI (R2 = 0,80), (C) perimetrului celular (R2 = 0,97) și (D) zonei celulare (R2 = 0.82) indică faptul că celulele C2C12 cultivate in vitro au prezentat o suprafață medie de 2057 xtx618 xtxm2 și o valoare medie a CSI de 0,37 xtx0,15 (n = 101 pentru B, C și D). Curbele roșii sunt potriviri gaussiene. (E) evoluția liniară a intensității fluorescenței actinei în funcție de zona celulară (R2 = 0,748, n = 28). Evoluția ariei totale de vinculină în funcție de (F) aria celulară (R2 = 0,783, n = 28) și (G) și intensitatea F-actinei (n = 28). (H) cronologia proliferării (în galben) și a diferențierii (în roșu) a mioblastelor C2C12 in vitro. Săgeata neagră indică înlocuirea mediilor de proliferare cu medii de diferențiere. (I,J) raportul de Aspect al mioblastelor la P0, P2 (stadii de proliferare, medie = 0,40 0,16 la p0, N = 150 pentru ambele) și D2 (etapă de diferențiere, medie = 0,24 0,07 la 0,00, n = 100).

am cuantificat indicele formei celulare (CSI) care a caracterizat morfologia mioblastelor oferind informații despre alungirea celulară. Celulele rotunjite au o CSI aproape de 1, în timp ce celulele alungite au o CSI aproape de 0. Am găsit CSI variind de la 0,1 la 0,8 cu o valoare medie de 0.37 0,15 (N = 101), sugerând o variabilitate mare a morfologiilor celulare (Fig. 1B). Mioblastele au prezentat un perimetru mediu de 259 int. 82 int. m (Fig. 1C, n = 101) și o gamă largă de arii de împrăștiere (de la ~1000 la ~4000 oktcm2), cu o valoare medie de 2057 oktc618 oktcm2 (Fig. 1D, n = 101). Aceste constatări obținute pe mioblastele C2C12 au fost întărite prin efectuarea unor măsurători morfologice suplimentare (CSI, perimetrul celular și aria celulară) pe mioblastele umane primare (16ubic, suplimentar Fig. 2A) care provin din bicepsul unui pacient neafectat de FSHD (adică. care au fost confirmate că nu au o ștergere 4qA). Așa cum se arată în Fig suplimentar. 2B-D, rezultatele noastre demonstrează că CSI a mioblastelor 16ubice a variat de la 0,14 la 0,86 cu o valoare medie de 0,44 0,17 (n = 90), sugerând o variabilitate mare a morfologiilor celulare pentru mioblastele umane, așa cum s-a observat pentru celulele C2C12. Luate împreună, rezultatele noastre demonstrează că variabilitatea morfologiilor celulare nu depinde de tipul de celulă sau de orice artefact al culturii celulare.

am studiat apoi distribuția filamentelor de actină într-o populație de mioblaste C2C12 pentru a înțelege dacă zonele de răspândire a variabilității pot modula citoscheletul actinei. Constatările noastre au arătat că intensitatea fluorescenței totale a rețelei F-actinei a fost liniar legată de aria celulară (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), sugerând că cu cât răspândirea mioblastului este mai mare, cu atât se formează mai multe filamente de actină. Așa cum se arată în Fig suplimentar. 3, am caracterizat apoi distribuția aderențelor conținute de vinculină pentru a determina modul în care variațiile formei celulare afectează interacțiunile celulă-substrat în mioblastele C2C12. Am constatat că suprafața totală a aderențelor celulă-substrat pe celulă a crescut cu suprafața celulei (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) și cu intensitatea fluorescenței F-actinei (Fig. 1G). Rezultatele noastre indică faptul că mioblastele C2C12 își asumă o varietate de forme celulare și zone de răspândire, dar la rândul lor adaptează atât cantitatea de filamente de actină, cât și aderențele de vinculină la răspândirea lor. Pentru a obține mai multe informații despre rolul formei celulare pentru diferențierea mioblastelor, luăm în considerare evoluția raportului de aspect celular în timpul proliferării (P0 la 6 ore și P2 la 48 ore) și diferențierea (D2 la 96 ore) etape (Fig. 1H). Așa cum se arată în Fig. 1I, J, constatările noastre arată că mioblastele și-au crescut raportul de aspect de la 0,40 0,16 (p0) la 0,36 0,09 (P2) și 0,24 0,07 (D2), sugerând că mioblastele se alungesc semnificativ și adoptă un raport de aspect de 1:4 pentru a se diferenția. În plus, rezultatele noastre au indicat faptul că fibrele de stres ale actinei au fost foarte orientate la D2 (Fig suplimentar. 4A, B), corespunzând și unor alungiri nucleare semnificative (Fig. 4C). Luate împreună, descoperirile noastre arată că rețeaua F-actină este modulată prin modificări ale morfologiei mioblastelor și indică faptul că diferențierea mioblastelor a necesitat alungirea celulară până la un raport de aspect de 1:4.

organizarea spațială a rețelei actinice și a nucleului este dirijată de morfologia mioblastelor

am controlat variabilitatea intrinsecă a morfologiilor mioblastelor prin utilizarea micropatternelor adezive pentru a standardiza zonele lor de răspândire și a controla formele lor. Prin utilizarea unei tehnici de imprimare microcontact20, am creat micropatterns adezive de fibronectină (FN), cu o suprafață constantă de 1600 mmc2 și geometrii diferite. Am folosit rotunjit (CSI = 1), pătrat (CSI = 0,79), triunghiular (CSI = 0,60) și diferite rapoarte de aspect dreptunghiulare (CSI = 0,50 și 0,34 pentru 1: 4 și 1:7 rapoarte de aspect, respectiv) FN micropatterns la cultura mioblaste individuale (Fig. 2A). Aceste geometrii diferite ale micropatternelor au permis standardizarea in vitro a formei mioblastului pe o gamă largă și controlul zonei lor de răspândire.

Figura 2

organizarea spațială a rețelei actinice și a nucleului este dirijată de morfologia mioblastelor. (A) Imagini de Epifluorescență ale celulelor C2C12 crescute pe micropatterni de fibronectină (FN) de 1600 unktm2 și imunosteinizate pentru F-actină (verde), nuclee (albastru) și vinculină (roșu). Micropatternele circulare, pătrate, triunghiulare și dreptunghiulare (raporturi de aspect 1:4 și 1:7) corespund CSI = 1, 0,79, 0,60, 0,50 și, respectiv, 0,34. Barele de scară sunt de 20 de metri cubi. (B) exemple tipice de organizare spațială a filamentelor de actină în celulele micropattern c2c12 care sunt codificate în culori în conformitate cu orientările lor. Barele de scară sunt de 20 de metri cubi. (C) orientarea rețelei de actină în mioblaste micropatterne dreptunghiulare rotunjite (n = 12 în negru), pătrate (n = 11 în roșu), triunghiulare (n = 19 în albastru) și 1:4 (N = 18 în verde) sau 1:7 (N = 11 în roz). Evoluția (D) a raportului de aspect nuclear și (E) a orientării nucleare pentru diferite geometrii ale mioblastelor (10 la sută n la sută 15 la sută pentru fiecare CSI).

pentru a determina cantitativ rolul geometriei celulare asupra organizării spațiale a citoscheletului de actină, am determinat orientarea filamentelor de actină pentru fiecare formă de celulă34,35. Filamentele de actină colorate cu faloidină au fost codificate prin culori în funcție de orientarea lor cu un gradient de culoare variind de la albastru deschis atunci când filamentele de actină au fost organizate paralel (0%) cu axa orizontală și roșu (+90%) sau portocaliu (-90%) pentru cele organizate perpendicular pe axa orizontală (Fig. 2B). S-a observat că filamentele de actină din celulele rotunjite au fost distribuite aleatoriu, cu orientări cuprinse între -90 și +90. Celulele pătrate au prezentat filamente de actină organizate în trei domenii unghiulare principale: 0° la 25°, 50° la 90° și -50° -90°, întrucât triunghiular celule arătat filamente de actina, în principal, organizat în funcție de cele trei părți de modelul de la 0°, 60° -60°. Interesant, am constatat că filamentele de actină au fost foarte orientate paralel cu axa lungă a celulei (0%) pentru celulele dreptunghiulare de raporturi de aspect 1:4 (CSI = 0,50) și 1:7 (CSI = 0,34). Cuantificarea aderențelor care conțin vinculină nu a indicat diferențe statistice ale zonelor de aderență între morfologiile celulare(Fig suplimentar. 5A-C), în timp ce orientarea aderențelor focale a fost modulată prin forma celulei (Fig suplimentar. 5D, E), așa cum s-a observat pentru filamentele de actină. Constatările noastre arată că atât mioblastele dreptunghiulare 1:4, cât și 1: 7 permit o organizare mai puternică a citoscheletului actinei (Fig. 2C) și aderențele focale, sugerând că alungirea mioblastelor duce la formarea dipolilor contractili.având în vedere rolul nucleului celular în diferențierea mioblastelor în miotuburi, am investigat apoi dacă modificările formei celulare și ale arhitecturii citoscheletului pot modula forma și orientarea nucleului36. Am constatat că raportul de aspect nuclear a crescut semnificativ odată cu scăderea CSI (Fig. 2D). Într-adevăr, celulele rotunjite (CSI = 1) pe micropatternele circulare au prezentat un nucleu rotunjit caracterizat printr-un raport mediu de aspect de 1,11 0,06, în timp ce celulele dreptunghiulare cu un raport de aspect de 1:4 (CSI = 0,50) și 1:7 (CSI = 0,34) au prezentat deformări nucleare mari cu rapoarte de aspect de 1,39 0,21 și, respectiv, 2,19 0,23. De asemenea, am observat că orientarea nucleului a fost modulată de morfologia celulară (Fig. 2E). Am constatat că orientarea nucleului în celule rotunjite, pătrate și triunghiulare a cuprins o gamă largă de unghiuri (de la ~15 la ~60 la sută), cu o orientare medie de ~40 la sută (circulară, n = 11), ~33 la sută (pătrată, n = 14) și ~43 la sută (triunghi, n = 10) în raport cu axa orizontală. Pentru celulele rectangulare, rezultatele noastre au indicat faptul că nucleul a fost orientat paralel cu axa celulară cu un unghi mediu de ~14 (1:4, n = 15) și ~2) (1:7, N = 10).

alungirea celulelor îmbunătățește contractilitatea mioblastelor

următoarea întrebare pe care am abordat-o a fost modul în care modificările formei celulare afectează contractilitatea mioblastelor. Pentru a răspunde la această întrebare, am folosit microscopia forței de tracțiune (TFM) pentru a determina tensiunile de tracțiune exercitate de mioblastele micropatterate. Așa cum se arată în Fig. 3A am observat că tensiunile maxime au fost exercitate la extremitățile mioblastelor micropatternate, indiferent de forma celulei. Așa cum s-a observat anterior la alte tipuri de celule37, stresul contractil s-a acumulat preferențial în colțuri (pătrate și triunghiuri) sau la ambele extremități (dreptunghiuri 1:4 și 1:7) ale mioblastelor micropatterate. Am cuantificat stresul total exercitat de mioblastele individuale micropatterate pentru a determina dacă morfologia celulară modulează contractilitatea celulară. Așa cum se arată în Fig. 3B, celulele rotunjite (CSI = 1) au exercitat o tensiune totală de 170,7 int.46,4 N/m2, în timp ce celulele dreptunghiulare (CSI = 0,34, raport de aspect 1:7) au exercitat o tensiune totală mai mare (295,9 int. 156.8 N / m2), sugerând că formele alungite ale celulelor duc la solicitări crescute de tracțiune. De asemenea, s-a constatat că celulele de formă dreptunghiulară (CSI = 0,34, raport de aspect 1:7) au prezentat valoarea maximă mai mare a tensiunii (684,3 inkt 257,8 Pa, Fig. 3C), în timp ce mioblastele rotunjite au prezentat cea mai mică valoare maximă de stres (351,5 inktual123,6 Pa). Având în vedere că tensiunile contractile au fost exercitate la periferia celulei și că scăderea CSI duce la creșterea tensiunilor de tracțiune, am trasat valoarea maximă a stresului în funcție de Distanța de la Centrul de masă până la extremitatea celulei (Fig. 3D), care reprezintă 22,6 XIF (CSI = 1), 28,28 XIF (CSI = 0,79), 33,98 XIF (CSI = 0,60), 41,23 XIF (CSI = 0,50) și 53,45 XIF (CSI = 0,34). Așa cum se arată în Fig. 3D, am constatat că stresul contractil maxim a crescut liniar cu Distanța de la centroid la extremitatea celulei (R2 = 0,958, n = 65), sugerând că morfologiile alungite ale mioblastelor exercită mai multe forțe de tracțiune.

pentru a determina contribuția rețelei de actomiozină la stabilirea forțelor contractile în mioblaste, celulele C2C12 au fost tratate cu medicamentul de sechestrare a g-actinei Latrunculină B (LatB) și cu inhibitorul de miozină ii Blebistatin (Bleb). Mioblastele imunosteinizate cu faloidină au indicat faptul că celulele tratate cu LatB și Bleb au prezentat o rețea difuză de actină (Fig. 3E), demonstrând că ambele medicamente au afectat semnificativ organizarea F-actinei. Am folosit TFM pe mioblastele micropatterate tratate cu ambele medicamente pentru a determina rolul rețelei actomiozinei în stabilirea forțelor contractile în mioblastele de diferite geometrii. Descoperirile noastre indică faptul că tratamentul cu LatB a indus o pierdere semnificativă a contractilității, care a crescut odată cu alungirea celulelor. Într-adevăr, celulele rotunjite au prezentat o pierdere a stresului contractil de ~62%, în timp ce celulele dreptunghiulare 1:4 și 1:7 tratate cu LatB au fost caracterizate printr-o pierdere a stresului contractil de ~88% și, respectiv, ~86% (Fig. 3F). În plus, am constatat că stresul contractil al 1:4 celule dreptunghiulare tratate cu Bleb au fost caracterizate printr-o pierdere de ~80% din forța contractilă, demonstrând că motoarele moleculare ale miozinei II sunt jucători cheie ai forțelor contractile mioblaste.

luate împreună, aceste rezultate indică faptul că contractilitatea rețelei de actomiozină este îmbunătățită în mioblaste alungite prin stabilirea unei rețele dense de fibre paralele de actomiozină.

contractilitatea perechilor celulare a crescut după fuziunea lor și a crescut pe micropatterns alungite

pentru a înțelege modul în care morfologia mioblastelor poate afecta proprietățile contractile ale miotuburilor, considerăm un model minim de două mioblaste. Am determinat mai întâi forțele de tracțiune exercitate de dubletele celulare la P1 (24 h în medii de proliferare) placate pe micropatterns de diferite forme (suplimentar Fig. 6A). Nu au existat diferențe statistice ale stresului contractil între gama largă de CSI (Fig suplimentar. 6B), în ciuda unei orientări bine definite a rețelei de actină (Fig suplimentar. 6C) și nucleele (Fig. 6D, E) pe 1:4 și 1:7 micropatterns dreptunghiulare. Pe baza acestei observații, am cuantificat apoi stresul contractil exercitat de dubletele celulare cultivate pe micropatternele circulare (CSI = 1) și dreptunghiulare (CSI = 0,50, raport de aspect 1:7) Fn pe parcursul a încă cinci zile (D5, Fig. 1H) în mediu de diferențiere. Am folosit MitoTracker Red CMXRos( ThermoFisher Scientific), o colorare mitocondrială vie, pentru a ne asigura că dubletele mioblaste au fost topite (Fig. 4A) 38. Așa cum se arată în Fig. 4B, C, S-a constatat că stresul contractil total a fost ușor crescut la dubletele cu celule fuzionate cultivate pe micropatternuri circulare (267 int.64 pa) comparativ cu dubletele cu celule circulare nefuzate (157 int. 37 Pa), în timp ce dubletele alungite fuzionate au fost de peste două ori mai contractile (543 int. 193 Pa) decât dubletele alungite nefuzate (211 int. 73 Pa). Aceste rezultate indică faptul că contractilitatea celulară a crescut după fuziunea celulară și a fost semnificativ îmbunătățită pentru morfologiile alungite.

Figura 4

contractilitatea perechilor celulare a crescut după fuziunea lor și a crescut pe micropatterns alungite. (A) imagini de Epifluorescență ale perechilor de celule C2C12 nefuzate (D) și fuzionate (FD) pe micropatterns FN circulare și dreptunghiulare (raport de aspect 1:7) și colorate pentru mitocondrii cu Mito Tracker. Barele de scară sunt de 20 de metri cubi. (B) hărți reprezentative ale stresului contractil exercitat de perechile de celule C2C12 fuzionate pe micropatternele FN circulare și dreptunghiulare. (C) evoluția tensiunii totale pentru perechile de celule c2c12 nefuzate (d), (bare simple) și topite (FD, bare hash) pe micropatternele FN circulare (în gri) și dreptunghiulare (în violet). Cercul D: n = 8; Cercul FD: n = 5; dreptunghiul D: n = 6 și dreptunghiul FD: n = 8. ** p < 0.01.

contractilitatea Actomiozinei promovează diferențierea miotuburilor

am întrebat apoi dacă contractilitatea actomiozinei mioblastelor ar putea influența diferențierea miotuburilor. Mioblastele C2C12 au fost cultivate pe substraturi acoperite cu FN în medii de proliferare timp de 2 zile (P2, Fig. 1H) pentru a ajunge la confluența celulară. Apoi, fie LatB, fie Bleb au fost adăugate timp de 30 de minute, iar mediul de proliferare a fost înlocuit cu un mediu de cultură de diferențiere. După 4 zile în mediu de diferențiere (D4, Fig. 1h), celulele C2C12 au fost fixate și colorate pentru ADN și TroponinT, un marker de diferențiere (Fig. 5). Am evaluat efectul tratamentelor cu LatB și Bleb prin colorarea alfa actininei asupra miotuburilor de control (CTRL) și miotuburilor tratate cu Latrunculină B (+LatB) și blebbistatină (+Bleb). După cum se observă în Fig. 7, miotuburile de control prezintă modele tipice de bandă z striate, în timp ce tratamentele cu LatB și Bleb perturbă modelele de striere din miotuburi. Miotuburile de Control (CTRL) au fost caracterizate printr-un raport mediu de aspect de 7,99 3,38 (Fig. 5A) și o arie t de troponină pozitivă de 51,7 inkt 5,6% (Fig. 5B). Constatările noastre indică faptul că tratamentele cu LatB și Bleb au scăzut fracțiunea din zona troponinei T la 44,9 5,2% și, respectiv, 44,4 5,1%. În plus, s-a constatat că indicele de fuziune a fost statistic mai mic pentru celulele tratate cu LatB (27% 3%) și blebb (29% 3%) decât pentru celulele de control (38% 5%), consolidând rolul contractilității actomiozinei în diferențierea mioblastelor (Fig. 5C). Luate împreună, aceste rezultate au indicat faptul că contractilitatea actomiozinei mioblastelor promovează diferențierea miotuburilor.

Figura 5

contractilitatea Actomiozinei promovează diferențierea miotuburilor. (A) distribuția raportului de aspect myotube după 4 zile în medii de diferențiere (N = 114, R2 = 0,915). Evoluția (B) procentului de zonă pozitivă pentru troponina T și (C) indicele de fuziune în celulele de control (CTRL), celulele tratate cu LatB și Bleb (n = 20 pentru fiecare). (D) imagini tipice de epifluorescență ale miotuburilor de control (Ctrl), LatB și miotuburi tratate cu Bleb formate după 4 zile în medii de diferențiere. Miotuburile au fost imunosteinizate pentru ADN (albastru) și troponină T (roșu). Cantarul este de 100 de metri cubi. *p < 0,05, **p < 0,01 și n.s. nesemnificativ.

alungirea Mioblastelor declanșează exportul nuclear YAP, care este esențial pentru diferențierea mioblastelor în miotuburi

pentru a obține mai multe informații despre mecanismele intracelulare care controlează diferențierea miotuburilor, considerăm rolul YAP prin determinarea localizării sale fie în citoplasmă, fie în nucleul mioblastelor, unde se leagă și activează în loc de factori de transcripție39. În acest scop, am cuantificat raportul Yap citoplasmatic / nuclear în mioblastele micropattern (Fig. 6A și suplimentare Fig. 8). Alungirea celulelor pe 1:Micropatternele dreptunghiulare 4 și 1: 7 au crescut raportul Yap citosolic/nuclear (Fig. 6B), sugerând că alungirea celulelor declanșează exportul nuclear YAP prin forțe de compresiune nucleare exercitate de rețeaua actomiozină40. Pentru a verifica dacă localizarea YAP fie în citoplasmă, fie în nucleu este legată de etapele specifice ale procesului de diferențiere, am colorat Yap în celulele C2C12 după 24 h (P1) și 48 h (P2) ale etapei de proliferare și la 96 h (D2) și 264 h (D9) ale etapei de diferențiere (Fig. 6C și suplimentar Fig. 9). Interesant, rezultatele noastre au indicat că raportul Yap citoplasmatic/nuclear a crescut de la 0,37 0,07 la P1 la 0,68 0,06 la P2 și 0,67 0,06 la D2 și apoi a scăzut la 0,42 0,10 la d9 (Fig. 6D). Interesant este că raportul Yap citoplasmatic / nuclear la D9 s-a dovedit a fi statistic diferit de valorile P1, sugerând că raportul Yap citoplasmatic/nuclear în miotuburile diferențiate este similar cu cel al mioblastelor. Pentru a verifica aceste rezultate, am recoltat mioblaste în stadiul de proliferare P1 (24 h) și în stadiul de diferențiere D2 (96 h) și le-am izolat materialele citoplasmatice și nucleare. S-a efectuat o analiză a proteinei acidului bicinconinic (BCA), iar proteinele conținute în extracții citoplasmatice și nucleare au fost analizate prin electroforeză (Fig. 6E). Rezultatele noastre Western blot au indicat că raportul Yap citoplasmatic/nuclear a crescut de la 0,62 0,08 la P1 la 0,87 0,24 la D2 (Fig. 6F). Această cuantificare biochimică a YAP a demonstrat un export nuclear semnificativ YAP în diferențierea celulelor C2C12 și consolidarea constatărilor noastre.

Figura 6

alungirea Mioblastelor declanșează exportul nuclear YAP, care este esențial pentru diferențierea mioblastelor în miotuburi. (A) imagini de Epifluorescență ale celulelor C2C12 crescute pe micropatterns FN de 1600 mmc2 și imunosteinizate pentru YAP. Barele de scară sunt de 20 de metri cubi. (B) raportul Yap citoplasmatic la nuclear pentru diferitele morfologii mioblaste (n = 10 pentru fiecare). (C) imagini de Epifluorescență ale celulelor c2c12 confluente imunosteinizate pentru YAP în ziua 1 (P1, 24 h) a stadiului de proliferare și în ziua 2 (D2, 96 h) și Ziua 9 (D9, 264 h) a etapei de diferențiere. Cantarul este de 100 de metri cubi. (D) raportul Yap citoplasmatic la nuclear la P1 (n = 50), P2 (n = 30), D2 (n = 30) și D9 (n = 30). (E) analiza Western blot a expresiei YAP (65 kDa) în proliferarea și diferențierea C2C12. (F) rația de YAP citoplasmatică până la nucleară (valoarea medie a S. D.) în timpul proliferării și diferențierii (3 replici pentru fiecare afecțiune cu 20.106 celule/replică). (G) raportul Yap citoplasmatic la nuclear la D2 și indicele de fuziune (H) pentru celulele tratate cu control (CTRL) și leptomicină (LMB) la D4. **p < 0,01, ****p < 0,0001 și n.S nu este semnificativ.

pe baza acestor rezultate, am evaluat rolul YAP prin utilizarea leptomicinei B pentru a bloca exportul activ din nucleu prin legarea directă la exportin141. Într-adevăr, Alberto Elosegui-Artola și colegii săi au arătat recent că leptomicina B (LMB) poate fi utilizată eficient pentru a studia modul în care forțele contractile exercitate de citoscheletul conduc translocația nucleară YAP39. Prin tratarea mioblastelor C2C12 la P2 (48 h) cu LMB, am constatat că raportul citoplasmatic la Yap nuclear a fost semnificativ mai mic în celulele tratate cu LMB la D2 (96 h, Fig. 6G), sugerând că YAP este concentrat în principal în nucleu atunci când exportul nuclear este inhibat. În plus, constatările noastre au indicat faptul că indicele de fuziune la D4 al celulelor tratate cu LMB (Fig. 6H) a fost foarte scăzută (3.8 1.5%) comparativ cu celulele de control (42,4% 9,1%), demonstrând că exportul nuclear activ este necesar pentru diferențierea C2C12.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.