ADN triplu helix formarea: un instrument potențial pentru repararea genetică

*autor corespondent: D. V. Kohli
Departamentul de științe Farmaceutice, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, India
E-mail:

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Oligonucleotidele care formează triplă helix, care se leagă de ADN dublu catenar, prezintă un interes special, deoarece sunt direcționate către Gena în sine, mai degrabă decât către produsul său ARNm (ca în strategia antisens). Cu toate acestea, stabilitatea slabă a unora dintre aceste structuri ar putea limita utilizarea lor în condiții fiziologice. Liganzii specifici se pot intercala în triple helice ADN și le pot stabiliza. Această revizuire rezumă progresele recente în acest domeniu, subliniind în același timp obstacolele majore care rămân de depășit, înainte ca aplicarea tehnologiei triplex la repararea genelor terapeutice să poată fi realizată.

formarea Triplei spirale (fig. 1) recent a fost punctul central al unui interes considerabil din cauza posibilei aplicații în dezvoltarea de noi instrumente de biologie moleculară, precum și agenți terapeutici și din cauza posibilei relevanțe a structurilor h-ADN în sistemele biologice . În structurile intermoleculare, o secvență oligopirimidină-oligopurină a duplexului ADN este legată de o oligonucleotidă cu a treia catenă în canelura majoră .

au fost descrise două tipuri principale de Triple helice, în funcție de orientarea celei de-a treia catene . Primele complexe triple-elicoidale raportate au implicat a treia catenă pirimidică a cărei legare se sprijină pe legăturile de hidrogen Hoogsteen între o pereche de baze T-A și timină și între o pereche de baze C-G și citozină protonată . Oligonucleotida care conține (T, C) se leagă paralel cu catena oligopurină în așa-numitul motiv pirimidină. O a doua categorie de helice triple conține purine în a treia catenă, care este orientată antiparalel către Catena oligopurină. C·G * G și T * A tripletele de bază sunt formate după o schemă inversă de legare a hidrogenului Hoogsteen . Oligonucleotidele care conțin T și G pot forma, de asemenea, spirale triple a căror orientare depinde de secvența de bază .

formarea Triplei helixuri oferă un mijloc direct de manipulare selectivă a expresiei genelor în celulele în care ADN-ul triplu helice oferă noi perspective spre reglarea genei dirijate de oligonucleotide (fig. 2). Oligonucleotidele Formatoare de triplă helix sintetic (TFOs) se leagă cu afinitate și specificitate ridicată de Catena purinică din canelura majoră a secvenței homopurină – homopirimidină în ADN dublu catenar .

TFO sunt candidați buni pentru a fi utilizați ca agenți de legare a ADN-ului specific site-ului și sunt investigați pentru utilizarea lor ca potențiali agenți terapeutici. Au fost studiate în aplicații antisens, unde sunt concepute pentru a viza ARNm, aplicații antigene, unde controlează expresia genelor prin formarea Triplei helixuri și în aplicații care vizează proteinele, unde sunt utilizate ca aptameri .TFOs poate fi utilizat și în terapia genică, unde vizează secvența ADN a genei mutante pentru a preveni transcrierea acesteia. Tracturile bogate în purină se găsesc frecvent în regiunile promotorului de gene și s-a demonstrat că TFO direcționate către aceste situri de reglementare reduc selectiv transcripția genelor vizate, probabil prin blocarea legării activatorilor transcripționali și/sau formarea complexelor de inițiere. Modularea transcripției mediată de Triplex are o aplicație potențială în terapie, deoarece poate fi utilizată; de exemplu, pentru a reduce nivelurile de proteine considerate a fi importante în procesele bolii. TFOs poate fi, de asemenea, utilizat ca instrumente moleculare pentru studierea expresiei genelor și s-au dovedit a fi eficiente în diferite strategii de direcționare a genelor în celulele vii. TFOs se poate lega de regiunile polipurină / polipirimidină din ADN într-o manieră specifică secvenței. Specificitatea acestei legături ridică posibilitatea utilizării formării triplex pentru modificarea genomului direcționat, cu scopul final de a repara defectele genetice ale celulelor umane. Mai multe studii au demonstrat că tratamentul celulelor de mamifere cu TFOs poate provoca repararea și recombinarea ADN-ului, într-un mod care poate fi exploatat pentru a introduce modificările secvenței dorite. Au fost raportate o serie de studii în care oligonucleotidele au fost utilizate ca compuși antigeni în celule .

formarea ADN-ului triplu helix

formarea Triplei helix este rezultatul legării oligoinucleotidelor cu o specificitate ridicată de recunoaștere la canelura majoră a ADN-ului dublu elicoidal prin formarea legăturilor de tip Hoogsteen cu bazele purinice ale perechilor de baze Watson-Crick, compusul proiectat rațional pentru reglarea artificială a expresiei genelor . Formarea Triplex necesită ioni Mg2+, în timp ce este inhibată de ionii K+.

în strategia triplă helix sau antigen, oligonucleotida se leagă în canelura majoră a ADN dublu catenar prin legarea hidrogenului Hoogsteen pentru a forma o triplă helix . TFO leagă secvențele homopurină-homopirimidină în ADN dublu catenar. Există patru motive structurale pentru formarea triplexului care au fost descrise pe baza compoziției celei de-a treia catene și a orientării sale față de Catena bogată în purină a duplexului. Motivul purinic TFOs (cele care sunt compuse din G și A) formează tripletele G*G:C și a*A:T și se leagă în orientare antiparalelă în ceea ce privește Catena purină a duplexului. Pe de altă parte, motivul pirimidinic TFOs (C/T) formează triplexuri în orientare paralelă și, în general, numai la pH scăzut datorită necesității protonării bazelor citozinei pentru a forma legături Hoogsteen; ele formează triplete C+*G:C și T*A:T. În cele din urmă, TF-urile mixte de purină și pirimidină se leagă fie în orientare paralelă, fie antiparalelă și formează triplete G*G:C și T*A:T. Orientarea în care se leagă motivul mixt TFOs depinde de numărul de pași GpA și ApG din tractul homopurinic . Orientarea antiparalelă este favorizată de un număr mai mare de pași, în timp ce un număr redus de pași favorizează orientarea paralelă .

odată stabilit cel mai bun motiv pentru legarea unei anumite secvențe țintă, problemele cu oligonucleotidele fosfodiesterice naturale limitează succesul abordării antigene și aplicațiile terapeutice ale oligonucleotidelor în general. Oligonucleotidele cu coloana vertebrală fosfodiesterică naturală sunt susceptibile la endo și exonucleaze. Activitatea predominantă care degradează oligonucleotidele este activitatea 3′-exonucleazei, dar activitatea endonucleazei a fost observată și în unele setări . Astfel, pentru aplicarea ca terapie in vivo, TFO trebuie să poată rezista atât activității exonucleazei, cât și activității endonucleazei pentru a-și atinge ținta. O modificare a coloanei vertebrale care conferă rezistență la nuclează, dar permite legarea la ADN dublu catenar cu afinitate ridicată este necesară pentru aplicațiile in vivo ale TFOs.

oligomerii morfolino Fosforodiamidați sunt oligonucleotide ale coloanei vertebrale modificate care au fost investigate anterior ca agenți antisens . Oligonucleotidele morfolino au o coloană vertebrală neîncărcată în care zahărul deoxiriboză al ADN-ului este înlocuit cu un inel cu șase membri, iar legătura fosfodiesterică este înlocuită cu o legătură fosforodiamidată (fig. 3). Oligonucleotidele morfolino sunt rezistente la degradarea enzimatică și par să funcționeze ca agenți antisens prin oprirea traducerii sau interferarea cu îmbinarea pre-ARNm, mai degrabă decât prin activarea Rnazei H. Acestea au fost livrate cu succes celulelor de cultură tisulară prin metode care perturbă fizic membrana celulară și un studiu care a comparat mai multe dintre aceste metode a constatat că încărcarea prin răzuire a fost cea mai eficientă metodă de livrare; cu toate acestea, deoarece coloana vertebrală morfolino este neîncărcată, lipidele cationice nu sunt mediatori eficienți ai absorbției oligonucleotidelor morfolino în celule . Un raport recent a demonstrat formarea triplex de către o oligonucleotidă morfolino și, din cauza coloanei vertebrale neionice, aceste studii au arătat că oligonucleotida morfolino a fost capabilă de formarea triplex în absența magneziului .

s-a demonstrat că cationii joacă un rol important în formarea Triplei spirale. Când oligonucleotidele fosfodiesterice sunt utilizate ca TFOs, magneziul este în general necesar pentru formarea triplexului cu purină și TFOs cu motive mixte; de asemenea, accelerează reacția și stabilizează triplexul format cu TFOs cu motive pirimidinice . S-a demonstrat că alți cationi bivalenți funcționează în aceeași capacitate ca magneziul în ceea ce privește formarea triplexului . Magneziul apare la o concentrație de ~0,8 mM în celulă și ~1,5 mM în sânge , dar majoritatea reacțiilor triplex in vitro sunt efectuate în 5-10 mM MgCl2. Potasiul apare în celulă la o concentrație de ~140 mM și la 4 mM în sânge. Concentrațiile mari de potasiu pot inhiba formarea triplexelor cu oligonucleotide bogate în guanină concepute ca TFOs prin favorizarea altor structuri ADN secundare, cum ar fi dimerii și cvadruplexurile . Va fi necesar să se depășească capacitatea limitată a fosfodiester TFOs de a forma un triplex în magneziu scăzut și potasiu ridicat pentru ca acestea să fie eficiente în condiții fiziologice. Într-un studiu recent al Morfolino TFOs, formarea triplexului a fost demonstrată în absența magneziului și în prezența potasiului. Aceste proprietăți fac din Morfolino TFOs candidați buni pentru studii ulterioare ca terapie antigenă.

modelarea moleculară

structura triplexă a ADN-ului poate fi construită prin tehnici de modelare moleculară folosind coordonate care iau în considerare în mod corect conformația de zahăr a elicelor triple (T,C) – motiv . Această structură este mai aproape de un ADN de formă B , raportat de studiile RMN, comparativ cu structura propusă, bazată pe difracția cu raze X a fibrelor. Programul JUMNA permite construirea structurilor ADN în funcție de parametrii lor elicoidali . Un sit de intercalare poate fi creat cu ușurință în triplex prin dublarea parametrului de creștere pentru două triplete de bază adiacente t·a (rise = 6.8) t (rise = 6.8) și, ulterior, scăderea parametrului de răsucire între aceste două triplete de la 34 la 16 pentru a reduce constrângerile de distanță a legăturii).

folosind modelarea moleculară, se poate demonstra posibilitatea formării unei spirale triple paralele în care firul unic interacționează cu duplexul intact din canelura minoră, prin interacțiuni de bază noi .

JUMNA folosește un amestec de coordonate elicoidale și interne (valență și unghiuri diedrice) pentru a descrie flexibilitatea acidului nucleic. Parametrii elicoidali poziționează fiecare nucleotidă 3 ‘ monofosfat în raport cu un sistem cu ax fix. Joncțiunile dintre nucleotidele succesive sunt menținute cu restricții pătratice pe distanțele O5′ – C5’. În plus față de un număr redus de variabile în ceea ce privește programele de coordonate carteziene, alegerea variabilelor semnificative din punct de vedere fizic permite mișcări conformaționale mari, concertate în timpul minimizării, împreună cu un control eficient al structurii și introducerea ușoară a constrângerilor sau restricțiilor. Instrumentele disponibile includ atât cartografiere adiabatică, cât și căutări combinatorii cu privire la parametrii structurali aleși. Particularitățile câmpului de forță Flex includ prezența unui termen specific pentru a explica dependența unghiulară a legăturii de hidrogen și posibilitatea screeningului electrostatic al energiei cu o funcție dielectrică sigmoidală , XV (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), unde R este distanța dintre două sarcini. Panta S, valoarea platoului la distanță lungă D și valoarea inițială D0 a funcției sunt reglabile, cu valori implicite de 0,16, 80 și,respectiv,1, Folosind două ipoteze deja utilizate pentru construirea helixului triplu cu canelură minoră . În primul rând, tripletele de bază sunt restrânse pentru a fi coplanare pentru a evita orice posibile interacțiuni triplete interbase. Astfel de interacțiuni se formează cu ușurință în timpul construcției helicelor întinse, dar nu pot juca un rol în recunoaștere sau schimb de fire, deoarece aceste procese sunt independente de secvența generală. S-a verificat că structura optimizată a triplexului cu canelură minoră este independentă de aceste restricții. A doua ipoteză, în conformitate cu stoichiometria complexelor RecA/ ADN, care prezintă trei nucleotide pe Monomer RecA, este utilizarea simetriei elicoidale trinucleotidice. Din acest motiv, studiile preliminare s-au limitat la secvențe cu repetare de trinucleotide.

sunt necesare restricții sau constrângeri specifice pentru construcția și manipularea triplex. Acestea includ restricțiile „platoului” și constrângerile de simetrie trinucleotidice, descrise anterior . Reținerea „platoului” menține co-planaritatea bazelor care formează un triplet, permițând în același timp rotațiile și deplasările necesare pentru comutarea perechilor de baze. Constrângerea de simetrie a trinucleotidelor implică echivalența variabilelor care descriu fiecare grup succesiv de trei nucleotide. Întinderea dsDNA, astfel încât răsucirea să scadă și canelura minoră să se deschidă au fost realizate anterior prin restrângerea distanței dintre atomii terminali O3′ ai unității de simetrie trinucleotidică. Această reținere a fost ușor modificată deoarece distanța O3′ – O3 ‘ poate fi modificată printr-o deplasare laterală a coloanei vertebrale în timpul schimbului de fire. Într-o lucrare recentă, numai componenta vectorului O3′ – O3’ paralel cu axa helixului a fost restrânsă. Restricțiile de pe lățimea canelurii, calibrate cu ajutorul calculelor electrostatice numerice Poisson-Boltzmann, au fost utilizate pentru a evita îngustarea canelurii din cauza lipsei moleculelor explicite de solvent .

comutarea perechilor de baze este studiată prin rotația bazei, folosind abordarea definită de Bernet și colab . Aceasta implică o reținere aplicată unghiului XV între legătura glicozidică (purină: C1′-N9 sau pirimidină: C1′-N1) și vectorul care unește cei doi atomi C1′ ai unei perechi de baze, proiectată pe planul perpendicular pe o axă elicoidală locală. în ADN-ul B canonic, valoarea de 55 de centimetrii este de 55 de centimetrii. Modelarea comutării perechilor de baze pentru o bază aleasă implică o variație adiabatică de la 65 la 10 la 10 la 2 la 2 la sută, menținând în același timp atât” platoul”, cât și restricțiile de întindere.

obstacolele și limitările întâlnite în formarea Triplei helixuri

aplicațiile biologice ale TFO sunt compromise de considerente biofizice fundamentale, precum și de limitările impuse de condițiile fiziologice. Formarea Triplex implică abordarea și legarea unui al treilea fir încărcat negativ la un duplex încărcat dublu negativ. Neutralizarea repulsiei de sarcină este de obicei furnizată experimental de niveluri de Mg++ (5-10 mM) care sunt mult mai mari decât ceea ce se crede că este disponibil în celule . Mai mult, formarea triplex implică modificări conformaționale din partea celui de-al treilea fir și o anumită distorsiune a duplexului subiacent . Triplexurile motivului pirimidinic sunt instabile la pH fiziologic din cauza cerinței de protonare a citozinei care are loc la pH relativ acid (pKa = 4,5). Acest lucru este necesar pentru a doua legătură de hidrogen Hoogsteen, deși sarcina pozitivă rezultată face aparent contribuția mai importantă la stabilitatea triplex . Triplexurile motivului pirimidinic care conțin citozine adiacente sunt adesea mai puțin stabile decât cele cu citozine izolate. În mod tradițional , acest lucru a fost atribuit efectelor de repulsie sarcină-sarcină, deși un studiu recent sugerează că protonarea incompletă a citozinelor adiacente poate fi factorul critic . În plus, al treilea motiv purinic toroane (care sunt bogate în G) pot forma tetrade G în niveluri fiziologice de K+, care inhibă formarea triplex . Toți acești factori impun bariere cinetice asupra formării triplexelor și reduc stabilitatea triplexelor odată formate (majoritatea triplexelor, chiar și în condiții optime in vitro, sunt mai puțin stabile decât duplexul subiacent .

strategii de contracarare a limitărilor

prima și cea mai importantă problemă întâlnită în strategia antigenului triplu elicoidal este instabilitatea triplexului format de TFOs în condiții fiziologice care limitează în consecință utilizarea acestei strategii foarte fascinante menite să corecteze genele într-o măsură variabilă. Prin urmare, au fost propuse diferite abordări și strategii pentru a conferi stabilitate structurii triple elicoidale formate.

oligonucleotida direcționată triple helices ar putea fi stabilizată prin utilizarea liganzilor acidului nucleic care stabilizează selectiv triple helices. De exemplu, s-a demonstrat că bromura de etidiu leagă și stabilizează o triplă helix din poli (dT)·poli (dA) poli (DT), care conține doar t·a tripleți T. Cu toate acestea, acest compus stabilizează slab (sau chiar destabilizează) triplele helice care conțin atât triplete de bază T·A-T și C·G-C-C+, probabil ca urmare a repulsiei electrostatice . Derivații de benzopiridoindol au fost primele molecule raportate pentru a stabiliza puternic acest ultim tip de helice triple, chiar dacă au o preferință pentru T * A se întinde pe T. Mai mulți alți intercalatori, precum și diferiți liganzi ai canelurilor minore ale ADN-ului s-au dovedit, de asemenea, că se leagă de helicele triple ale ADN-ului. De exemplu, helicele triple pot fi stabilizate prin modificarea chimică a oligonucleotidelor, cum ar fi psoralenul atașat la oligonucleotide, s-a dovedit că își îmbunătățește activitatea biologică după iradierea UV . Intercalatoarele stabilizează de obicei într-o măsură mai mare triplele helice care conțin t·a triplete t de la un sfert, în timp ce lianții cu caneluri minore destabilizează de obicei triplexurile, cu excepția unui caz particular în care tripla helix a implicat o catenă de ARN . Deoarece nu sunt disponibile date structurale despre complexele triple helix-ligand, nu se știe prea multe despre interacțiunile care direcționează intercalarea specifică în triple helices. Derivații BPI s-au dovedit a intercala între t·a tripleți de bază t de la T la t prin transferul de energie prin fluorescență de excitație de la tripleți de bază la liganzi și prin dicroism liniar și circular . S-a constatat că oligonucleotidele morfolino paralele cu pirimidină pot forma un triplex cu țintă duplex. Așa cum era de așteptat, acest motiv a necesitat un pH scăzut pentru formarea triplexului, așa cum este cerut de motivul pirimidină-paralel fosfodiester TFO. Este posibil să se depășească această dependență de pH cu substituții precum 5-metilcitozina pentru citozinele din TFO .

o abordare alternativă prin care helicele triple pot fi stabilizate este prin modificări chimice ale oligonucleotidelor, cum ar fi atașarea covalentă a unei molecule de acridină . S-a demonstrat că substituția acridinei crește puternic inhibarea scindării enzimei restrictin și, de asemenea, nu afectează specificitatea secvenței pentru formarea triplexului .

aplicații ale ADN-ului triplu Helix

formarea ADN-ului intermolecular triple helices oferă posibilitatea proiectării compușilor cu proprietăți extinse de recunoaștere a secvenței, care pot fi utile ca agenți antigeni sau instrumente în biologia moleculară . În ultimul deceniu, o nouă abordare care utilizează analogi ADN, ca agenți terapeutici, apare în chimia medicinală. Aceasta se bazează pe reglarea expresiei genelor proteinelor/enzimelor legate de boală prin blocarea transcripției lor (antigen) sau a traducerii (antisens) (fig. 4). Este afectat prin legarea specifică secvenței oligonucleotidelor complementare fie la duplexul ADN prin formarea triplex pentru a inhiba producția de ARNm, fie pentru a interfera în traducerea acestuia din urmă în proteine. Deoarece oligonucleotidele nu intră ușor în celule și pot fi distruse de nucleazele celulare, o varietate de analogi modificați chimic ai oligonucleotidelor sunt proiectați, sintetizați și evaluați pentru dezvoltare ca agenți terapeutici.

recunoașterea specifică a regiunilor homopurină-homo pirimidină în ADN duplex prin oligonucleotide Formatoare de triplex (TFO) oferă o strategie atractivă pentru manipularea genetică, cu scopul final de a repara defectele genetice ale celulelor umane. Abilitatea de a viza mutațiile se poate dovedi utilă, ca instrument pentru studierea reparării ADN-ului și ca tehnică pentru terapia genică și ingineria genetică .

instrumente eficiente bazate pe Triple helices au fost dezvoltate pentru diverse aplicații biochimice, cum ar fi dezvoltarea nucleazelor artificiale foarte specifice. Strategia antigenului rămâne unul dintre cele mai fascinante domenii de aplicare triplex pentru a controla selectiv expresia genelor (Tabelul 1). Direcționarea secvențelor genomice este acum dovedită a fi un concept valoros pe un număr încă limitat de studii; mutageneza locală este în acest sens o aplicație interesantă a oligonucleotidelor Formatoare de triplex, pe culturile celulare .

Table 1: Studiile de acid nucleic antigen în celulele Eucariote80

strategiile Antigene se concentrează în principal pe direcționarea genelor prin recombinare omoloagă sau prin oligodeoxinucleotide care formează triplu helix . Din mai multe motive tehnice, inclusiv accesibilitatea foarte limitată a genelor în structura cromozomială foarte malariacondensată, învelită în proteine, aplicarea clinică a acestor metode nu a progresat rapid. Kielkopf și colab au descris recent o abordare alternativă, folosind poliamide care pot difuza în nucleu și pot recunoaște secvențe specifice de ADN . Deși foarte interesantă, această metodologie este încă la început și utilitatea sa clinică finală rămâne necunoscută .

aplicații terapeutice ale tehnologiei antigene

ADN-ul triplu helix a atras atenția datorită aplicării potențiale a TFOs ca agenți terapeutici, pentru aplicații precum direcționarea genelor intracelulare, ca soluții chimice raționale pentru secvențierea recunoașterii specifice a unui duplex ADN și identificarea genelor responsabile de creșterea celulară și transformarea malignă . Cu aceste cunoștințe a venit o dorință naturală de a traduce aceste informații în noi strategii terapeutice specifice țintă pentru tratamentul cancerului, bolilor cardiovasculare și a altor maladii comune ale omenirii (Tabelul 2). Dezvoltarea recentă a unui inhibitor biochimic relativ specific al proteinei tirozin kinazei bcr/ABL la pacienții cu leucemie mielogenă cronică este un exemplu uimitor al acestei căutări . Pentru terapiile care vizează direct înlocuirea, repararea sau dezactivarea genelor cauzatoare de boli, progresul a fost mult mai lent și un succes echivalent cu inhibitorul biochimic bcr/ABL nu a fost încă atins. Motivele pentru aceasta sunt complexe și variază în funcție de tipul de terapie direcționată genetic utilizat .

Tabelul 2: unele boli care pot fi tratate prin terapie ADN

Stephenson și Zamecnik au arătat că o oligonucleotidă ADN scurtă (13nt) complementară inversă în secvență (antisens) la virusul sarcomului Rous ar putea inhiba replicarea în cultură. Una dintre cele mai importante proprietăți ale oligonucleotidelor antisens și antigene în utilizarea lor ca terapie este rezistența lor la nuclează. Oligonucleotidele fosforotioate sunt cel mai frecvent tip de oligonucleotide cu rezistență nucleazică relativ ridicată și au fost introduse pe piață ca medicamente împotriva retinitei induse de citomegalovirus . Oligonucleotidele cu un reziduu de acid nucleic 2′-O,4′ – C-etilenă (ENA) în a doua poziție de la capătul 3 ‘ prezintă o rezistență nuclează mult mai mare decât cele cu un reziduu de acid nucleic blocat (LNA) în aceeași poziție .

deși Kurreck și colab au raportat că oligonucleotidele LNA au fost stabile în serul uman , oligonucleotidele ENA parțial modificate au fost mult mai rezistente la nucleaze decât oligonucleotidele LNA din plasma de șobolan. Mai mult, oligonucleotidele modificate contiguu cu reziduuri ENA la capătul 3′ și 5′ prezintă o stabilitate mai mare decât cele modificate parțial. Astfel, oligonucleotidele ENA au un potențial ridicat ca agenți antisens și antigen care pot fi utilizați in vivo . Formarea triplexă specifică secvenței poate fi aplicată pentru direcționarea genelor, reducerea la tăcere a genelor și mutageneză .

perspective viitoare

Oligonucleotidele se pot lega în mod specific de o genă țintă de interes prin formarea Triplei helixuri. Oligonucleotidele care formează Triplex sunt concepute în prezent pentru a se lega de HER-2 (receptorul factorului de creștere epidermal uman 2)/ gena neu, o genă care este supraexprimată într-o mare varietate de tumori umane, inclusiv cancerul pulmonar cu celule mici, cancerul de sân, cancerul ovarian și tumorile GI. Această strategie va fi aplicabilă pe scară largă pentru a preveni exprimarea multor oncogene sau a altor gene legate de cancer. Aceste oligonucleotide „antigene” sunt acum utilizate pentru a furniza agenți de alchilare ADN la baze specifice din promotorul HER-2/neu și secvența de codificare, pentru a preveni inițierea și alungirea transcripției. În special, oligonucleotidele care formează triplex au fost utilizate pentru a furniza muștar de azot, cum ar fi clorambucil, la o bază specifică de guanină din gena HER-2/neu pentru a preveni expresia genelor. Strategia anti-cancer specifică țintă care implică oligonucleotide antigene cuplate cu medicamente active ADN se va dovedi a fi o piatră de hotar în viitorul apropiat.

1. Thuong, N. T. și Helene, C., Angew. Chem. Int., 1993, 32, 666
2. Mirkin, S. M. și Frank-Kamenetskii, MD, Anu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., 1994, 23, 541.
3. Patrizia, A., Paola B. A., Jean-Louis, M., Therese G., Claude H. andJian-Sheng S., Nucl. Acid. Res., 2002, 30, 5407.
4. Sun, J. S. și Helene, C., Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 3, 345.
5. le Doan, T., Perrouault, L., Praseuth, D., Habhoub, N., Decout, J. L., Thuong, N. T., Lhomme, J. și Helene, C., Nucl. Acid. Res., 1987,15, 7749.Moser, H. E. și Dervan, P. B., știință, 1987, 238, 645.
6. Beal, P. A. și Dervan, P. B., Știință, 1991, 251, 1360.
7. Pilch, D. S., Levenson, C. și Shafer, R. H., Biochimie, 1991, 30,6081.
8. DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Sun, J. S., Bisagni, E., Garestier, T. și Helene, C., Nucl. Acid. Res., 1996, 24, 1136.
9. McGuffie, E. M. și Catapano, C. V., Nucl. Acid. Res., 2002, 30,12, 2701.
10. Basye, J., Trent, J. O., Gao, D. și Ebbinghaus, S. W., Nucl. Acid.Res., 2001, 29, 4873.
11. Helene, C. și Toulme, J. J., Biochem. Biophys. Acta., 1990,1049, 99.
12. Helene, C., Eur. J. Cancer, 1994, 30, 1721.Stein, C. A. și Cheng, Y. C., Știință, 1993, 261, 1004.
13. Wagner, R. W., natură, 1994, 372, 333.
14. Praseuth, D., Guieysse, A. L., Helene, C., Biochem. Biophys.Acta., 1999, 1489, 181.
15. Sun, J. S., DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Montenay-Garestier, T. și Helene, C., C. R. Acad. Sci., 1991, 313, 585.
16. Gamper, H. B. J., Kutyavin, I. V., Rhinehart, R. L., Lokhov, S. G.,Reed, M. W. și Meyer, R. B., Biochimie, 1997, 36, 14816.
17. Eder, P. S., DeVine, R. J., Dagle, J. M. și Walder, J. A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.
18. Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X. și Wagner, R. W., Nucl. Acid.Res., 1993, 21, 3857.
19. Stein, D., Foster, E., Huang, S. B. ,eller AcidDrugDev., 1997, 7, 151.
20. Summerton, St AcidDrugDev., 1997, 7, 63. Summerton, Antis AcidDrugDev., 1997, 7, 187.
21. Hudziak, R. M., Barofsk. AcidDrugDev., 1996, 6,267.
22. Ghosh, C.,Stein ,D., eller, 2000, 313, 135.
23. Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
24. Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
25. Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
26. Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
27. Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
28. Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biochimie, 1993, 32, 13171.
29. Blume, S. W., Lebowitz, J., Zacharias, W., Guarcello, V., Mayfield, C. A., Ebbinghaus, S. W., Bates, P., Jones, D. E., Trent, J. andVigneswaran, N., Nucl. Acid. Res., 1999, 27, 695.
30. Darnell, J., Lodish, H. și Baltimore, D., În; Molecular Cellbiologyscientific American Books, New York, 1990, 531.
31. Suda, T., Mishima, Y., Asakura, H. și Kominami, R., Nucl. Acid.Res., 1995, 23, 3771.
32. Olivas, W. M. și Maher, L. J., Nucl. Acid. Res., 1995, 23, 1936.
33. Svinarchuk, F., Cherny, D., Debin, A., Delain, E. și Malvy, C., Nucl.Acid. Res., 1996, 24, 3858.
34. Faruqi, A. F., Krawczyk, S. H., Matteucci, MD și Glazer,p.m., Nucl. Acid. Res., 1997, 25, 633.
35. Blume, S. W., Guarcello, V., Zaharia, W. și Miller, D. M., Nucl.Acid. Res., 1997, 25, 617.
36. Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, J. S., Lavery, R. andTaillandier, E., Biochimie, 1993, 32, 2098.
37. Macaya, R. F., Schultze, P. și Feigon, J., J. Amer. Chem. Soc.,1992, 114, 781.
38. Radhakrishnan, I. și Patel, DJ, Biochimie, 1994, 33, 11405.
39. Arnott, S., Bond, P. J., Selsing, E. și Smith, P. J. C., Nucl. Acid.Res., 1976, 3, 2459.
40. Lavery, R. și Sklenar, H., J. Biomol. Struct. Dyn., 1988, 6, 63.
41. Bertucat, G., Lavery, R. și Prevost, C., J. Biomol. Struct. Dyn.,1998, 16, 535.
42. Lavery, R., Peyrard, M., Eds. În; excitație neliniară inbiomolecule, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin și NewYork, 1995, 57.Hingerty, B. E., Richtie, R. H., Ferrell, T. L. și Turner, J. E., biopolimeri, 1985, 24, 427.
43. Bernet, J., Zakrzewska, K. și Lavery, R., J. Mol. Struct.Teohem., 1997, 398-399, 473.
44. Pesco, J., Salmon, J. M., Vigo, J. și Viallet, P., Anal. Biochem.,2001, 290, 221.
45. Gilbert, D. E. și Feigon, J., Curr. Opin. Struct. Biol., 1990, 9, 305.
46. 50. Shimizu, M., Konishi, A., Shimada, Y., Inoue, H. și Ohtsuka, E.,FEBS. Let., 1992, 302, 155.
47. Asensio, J. L., Carr, R., Brown, T. și Lane, A. N., J. Amer.Chem. Soc., 1999, 121, 11063.
48. Asensio, J. L., Lane, A. N., Dhesi, J., Bergqvist, S. și Brown, T., J. Mol. Biol., 1998, 275, 811.
49. Volker, J. și Klump, H. H., Biochimie., 1994,33, 13502 .
50. Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. și Kawamoto, Y., Biochimie.,2001, 40, 9396.
51. Arimondo, P. B., Garestier, T., Helene, C. și Sun, J. S., Nucl. Acidre., 2001, 29, 15.
52. Michael, M., Seidman, M. M. și Peter, M. G., J. Clin.Investește., 2003,112, 487.
53. Panas Scaria, P. V. și Shafer, R. H., J. Biol. Chem., 1991, 266,5417.
54. Mergny, J. L., Collier, D., Rougee, M., Montenay-Garestier, T. andHelene, C., Nucl. Acid. Res., 1991, 19, 1521.
55. 59. Mergny, J. L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C. H., Perrouault,L., Faucon, B., Rougee, M., Montenay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., știință, 1992, 256, 1681.
56. Lee, J. S., Latimer, L. J. P. și Hampel, K. J., Biochimie, 1993, 32,5591.
57. Park, Y. W. și Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA,1992, 89, 6653.
58. Durand, M., Thuong, N. T. și Maurizot, J. C., J. Biol. Chem., 1992,267, 24394.
59. Durand, M., Thuong, N. T. și Maurizot, J. C., J. Biomol. Struct.Dyn., 1994, 11, 1191.
60. Kulka, M., Smith, C. C., Aurelian, L., Meade, K., Miller, P. și Ts ‘ o, P. O. P., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 1989, 86, 6868.
61. Chang, E. H., Miller, P. S., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts ‘ op.O. P. și Yu, Z. P., Biochimie, 1991, 30, 8283.
62. Pilch, D. S. și Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA,1994, 91, 9332.
63. Pilch, D. S., Waring, M. J., Sun, J. S., Rougee, M., Nguyen, C. H., BisagniE., Garestier, T. și Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.Kim, S. K., Sun, J. S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. și Norden, B., biopolimeri, 1997, 42, 101.
64. Lin, S. B., Kao, C. F., Lee, S. C. și Kan, L. S., AnticancerDrugDes., 1994, 9, 1.
65. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T. și Helen, C., Proc. Natl.Acad. Sci. SUA, 1991, 88, 3389.
66. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A.,Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T., Helen, C. și Harel-Bellan,A., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 1992, 267, 3389.
67. Gowers, D. M. și Fox, K. R., Nucl. Acid. Res., 1999, 27, 1569.
68. 73. Nagatsugi, F., Sasaki, S., Miller, P. S. și Seidman, M. M., Nucl.Acid. Res., 2003, 15, 31.
69. Melton, D. W., BioEssays, 1994, 16, 633.
70. Helene, C., Cancer, 1994, 30, 1721.
71. Majumdar, A., Khorlin, A. și Dyatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
72. Kielkopf, C. L., Baird, E. E. și Dervan, P. B., Nat. Struct. Biol.,1998, 5, 104.
73. Alan, M. și Gewirtz, M. D., J. Clin. Oncol., 2000, 18, 1809.
74. Rao, N. R. și Nalluri, B. N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
75. Varmus, E. S., I. Biosci. Rep., 1990,10,413.
76. Fearon, E. R. și Dang, C. V., Biol curent., 1999, 9, R62.
77. Hahn, W. C., Counter, C. M. și Lundberg, A. S., natură, 1999, 400.464.Druker, B. J. și Lydon, N. B., J. Clin. Investește., 2000, 105, 3.
78. Stephenson, M. L. și Zamecnik, P. C., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 1978, 75, 285.
79. gear Ge Farmacocinet.,2002, 41, 255.
80. Morita, K., Hasegaw Med. Chem.Let., 2002, 12, 73.
81. Kurreck, nu Acid.Res., 2002, 30, 1911.
82. Koizumi, M., Morita, K., Daigo, M., Tsutsumi, S., Abe, K., Obika, S. și Imanishi, T., Nucl. Acid. Res., 2003, 31, 3267.