ansambluri de motive diverse specifică activități non-redundante de legare a ADN-ului membrilor familiei AP-1 în macrofage

analize statistice

în Fig. 1C, diferențele în expresia genelor au fost testate folosind testul t independent (gradul de libertate = 1, cu două cozi) pe două experimente replicate (n = 2). Genele exprimate diferențiat în Fig. 1b au fost identificate folosind EdgeR55 cu parametrii implicite, și folosind cut offs FDR < 0.05 și log2 ori schimbare 2. În Fig. 2C, diferențele dintre fiecare grup (Veh, partajat și KLA 1 h) au fost examinate folosind testul t independent (gradul de libertate = 1, cu două cozi); numărul de loci din fiecare grup pentru fiecare monomer este după cum urmează ATF3 (Veh = 1447, partajat = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Semnificația motivelor din Fig. 4a a fost calculat folosind testul raportului de probabilitate (grad de libertate = 1) comparând predicțiile făcute de modelul TBA complet și modelul TBA perturbat la toate loci legat în macrofagele tratate cu Veh pentru Atf3 (n = 23,160), Jun (n = 15,548) și JunD (n = 19,653). Semnificația motivelor din Fig. 4C a fost calculat folosind testul raportului de probabilitate (grad de libertate = 1) comparând predicțiile făcute de modelul TBA complet și modelul TBA perturbat la toate loci legat de JunD în GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477) și SK-N-SH (38,960). Semnificația motivelor din Fig. 5b, suplimentar Fig. 5B și Fig. 5C a fost calculat folosind testul raportului de probabilitate (grad de libertate = 1) comparând predicțiile făcute de modelul TBA complet și modelul TBA perturbat la toate locurile legate în macrofagele tratate KLA pentru Atf3 (n = 36,745), Jun (n = 17,481), JunD (n = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619) și JunB (n = 13,376). Valori de semnificație pentru Fig. 6F și S6F au fost calculate folosind testul F; numărul de loci analizați pentru monomeri în macrofagele tratate cu vehicule sunt ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) și JunD (n = 4148); numărul de loci analizați pentru monomeri în macrofagele tratate cu KLA sunt: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) și JunB (n = 3616).

generarea genomului personalizat pentru BALB/cJ

un genom personalizat pentru BALB / cJ prin înlocuirea pozițiilor Invariante ale genomului mm10 cu alele raportate de Proiectul genomului Mouse-ului (versiunea 3 fișier VCF)43. Pentru C57BL / 6j a fost utilizat genomul de referință mm10 din browserul genomului UCSC. Pentru a permite comparații între BALB/cJ și C57BL/6J în timpul analizei, coordonatele genomului personalizat pentru BALB/cJ au fost deplasate pentru a se potrivi cu pozițiile genomului de referință mm10 folosind MARGE34. Nu am analizat nicio citire care a căzut în deleții în BALB / cJ. Citește că suprapuse cu o inserție au fost atribuite la ultima poziție de suprapunere în tulpina de referință.

analiza vârfurilor ChIP-seq

secvențierea citirilor din experimentele ChIP-seq au fost mapate la ansamblul mm10 al genomului de referință al mouse-ului (sau genomul personalizat BALBc / J) folosind cea mai recentă versiune a Bowtie2 cu parametri impliciți56. Mapate ChIP-seq citește pentru a identifica site-uri de legare TF putative cu comanda HOMER57 findPeaks (cu parametrii-Dimensiune 200-L 0-C 0-fdr 0.9), folosind experimentul cip de intrare corespunzătoare stării de tratament. Pentru a reduce numărul de vârfuri fals pozitive, am calculat IDR la fiecare vârf (folosind versiunea 2.0.3 din programul idr) cu scorul HOMER peak calculat pentru fiecare experiment replicat ca intrare la IDR și apoi filtrat toate vârfurile care au avut IDR 0,0558. Motivele de novo au fost calculate cu HOMER findMotifsGenome.pl Comandă cu parametrii impliciți. Îmbogățirea motivelor de novo a fost calculată folosind findKnownMotifs.pl program în HOMER cu parametrii impliciți.

cuantificarea expresiei ARN citirile generate de experimentele ARN-seq au fost aliniate la genomul de referință al mouse-ului mm10 (sau genomul personalizat BALBc / J) folosind STAR aligner cu parametrii impliciți59. Pentru a cuantifica nivelul de Expresie al fiecărei gene, am calculat RPKM cu citirile care se aflau într-un exon. Citirile de secvențiere ne-normalizate au fost utilizate pentru a identifica genele exprimate diferențiat cu EdgeR55; am considerat genele cu FDR < 0,05 și o schimbare a expresiei între două condiții experimentale de două ori sau mai mari exprimate diferențiat. Pentru a cuantifica expresia ARN-urilor în curs de formare, am adnotat vârfurile noastre ChIP-seq cu numărul de citiri GRO-seq (normalizate la 10 milioane) care se aflau la 500 bps de centrul de vârf folosind HOMER annotatePeaks.pl comandă.

formarea modelului TBA

pentru fiecare monomer AP-1 sub fiecare condiție de tratament, am instruit un model pentru a distinge situsurile de legare pentru fiecare monomer dintr-un set de loci genomici selectați aleatoriu. Setul de loci de fundal aleatoriu folosit pentru a instrui fiecare model a fost selectat în conformitate cu următoarele criterii: (1) distribuția conținutului GC a loci de fundal se potrivește cu conținutul GC al site-urilor de legare pentru un monomer dat, (2) nu conține poziții ambigue sau unmappable și (3) Numărul de secvențe de fundal se potrivește cu numărul de site-uri de legare k. Pentru fiecare dintre secvențele din setul combinat de site-uri de legare și loci de fundal, am calculat cel mai mare scor log-odds (denumit și scor motiv) pentru fiecare dintre n motive care vor fi incluse în model60 au fost luate în considerare potrivirile motivului în ambele orientări. Scorurile Log-odds mai mici de 0 au fost setate la 0. Conform procedurilor standard de preprocesare înainte de formarea unui model liniar, am standardizat scorurile log-odds pentru fiecare motiv, scalând setul de scoruri pentru fiecare motiv, astfel încât valoarea medie să fie 0, iar varianța să fie 1. Standardizarea scalează scorurile pentru toate motivele la același interval (motivele mai lungi au un scor maxim mai mare) și, de asemenea, ajută la reducerea efectului multi-colinearității asupra formării modelului. Și astfel, caracteristicile utilizate pentru formarea modelului nostru este o matrice n de 2K a scorurilor log-odds standardizate pe fiecare rând. Pentru a genera matricea corespunzătoare de etichete, am atribuit fiecărui site de legare o etichetă de 1 și fiecărui loci de fundal o etichetă de 0. Folosind această matrice de caracteristici și matrice de etichete, am antrenat greutăți pentru fiecare motiv folosind un model de regresie logistică penalizat L1, implementat de pachetul scikit-learn Python 61. Ponderile motivelor prezentate în analiza noastră sunt valorile medii pe parcursul a cinci runde de validare încrucișată, folosind 80% din date pentru antrenament și 20% pentru testare în fiecare rundă. Modelele au fost instruite pentru cipuri-seq generate în acest studiu, precum și date descărcate de pe expresia genelor NCBI Omnibus (număr de aderare GSE46494) și portalul de date ENCODE (https://www.encodeproject.org).

cuantificarea colinearității multiple

pentru a evalua gradul de multi-colinearitate în caracteristicile scorului motif pe care le-am folosit pentru a ne antrena modelele, am luat fiecare matrice de caracteristici corespunzătoare fiecărui experiment și am calculat VIF pentru fiecare motif38. Pentru a calcula VIF, determinăm mai întâi coeficientul de determinare, R2, pentru fiecare motiv prin regresarea scorurilor log-odds pentru un motiv față de scorurile log-odds ale motivelor rămase. Apoi folosind coeficientul de determinare, toleranța pentru fiecare motiv poate fi calculată ca diferența dintre 1 și coeficientul de determinare (1 − R2). VIF este reciproca toleranței \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Am folosit modulul linear_model al pachetului Sklearn Python pentru a calcula coeficientul de determinare.

gruparea motivelor și fuzionarea

am obținut similitudinea tuturor perechilor de motive ale secvenței ADN prin calcularea corelației Pearson a matricelor de probabilitate a poziției aliniate (PPMS) corespunzătoare unei perechi date de motifuri62. Corelația Pearson pentru o pereche de motive a și B de lungime i se calculează folosind formula:

ppm–urile au fost aliniate mai întâi folosind algoritmul de aliniere Smith-Waterman 63. Motivele mai scurte sunt căptușite cu valori de frecvență de fundal înainte de aliniere. Nu au fost permise lacune în aliniere și fiecare poziție din aliniere a fost marcată cu corelația Pearson. Corelația Pearson a fost apoi calculată folosind alinierea optimă. Apoi, seturi de motive care au ppm-uri cu o corelație Pearson de 0,9 sau mai mare au fost îmbinate prin alinierea iterativă a fiecărui PPM în set și apoi prin medierea frecvențelor nucleotidelor la fiecare poziție.

evaluarea semnificației motivelor pentru TBA

Valorile p pentru TBA au fost calculate utilizând testul raportului log-probabilitate. Fiecare motiv a fost eliminat din setul de caracteristici utilizate pentru a antrena un model TBA perturbat (folosind validarea încrucișată de cinci ori). Apoi am folosit modelul complet (care conține toate motivele) și modelul perturbat pentru a calcula probabilitatea de a observa legarea pe toate siturile de legare și secvențele de fundal pentru un monomer dat și toate regiunile de fundal. Diferența dintre probabilitățile calculate de modelul complet și modelul perturbat a fost apoi utilizată pentru a efectua testul chi-pătrat pentru fiecare motiv. Testul chi-pătrat a fost efectuat folosind pachetul SciPy python package64.

comparație cu alte metode

motivul BaMM și GKM-SVM au fost ambele rulate cu parametrii impliciți. Am folosit cea mai recentă versiune a scalei mai mari GKM-SVM, LS-GKM (compilate din codul sursă descărcat de la https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm pe 8/25/16) și motivul BaMM; v1.0 descărcat de la https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Ambele modele au fost instruite folosind validarea încrucișată de cinci ori. Performanța modelului a fost marcată folosind funcțiile roc_auc_score și precision_score din modulul metrics al sklearn.

prezicerea modificărilor legării AP-1 după un tratament KLA de o oră

pentru a prezice schimbarea legării după tratamentul KLA, am folosit greutățile motivelor învățate pentru fiecare dintre motivele n (wn) printr-un model TBA instruit pe datele tratate de vehicul (Wveh = ) și un model TBA instruit pe datele tratate KLA de 1-h (Wkla = ) pentru fiecare monomer AP-1. Modificarea prezisă a legării pentru fiecare secvență este apoi diferența dintre produsul punct al scorurilor motivelor standardizate calculate pentru secvența fiecare dintre siturile de legare k (sk = ) cu greutățile motivului KLA și produsul punct al scorurilor motivelor și greutățile motivului Veh (Inktikla−veh,k = Wkla Int sk − Wveh Int sk). S-au făcut predicții pentru toți locii genomici care s-au intersectat cu un vârf pentru unul dintre monomerii AP-1 fie în vehicul, fie în starea de tratament KLA.

prezicerea legării specifice tulpinii cu TBA

pentru a prezice legarea specifică tulpinii, am valorificat greutățile motivelor învățate pentru fiecare dintre motivele n (wn) printr-un model TBA (W = ) pentru fiecare monomer AP-1 folosind datele C57BL/6j și scorurile motivelor calculate pentru fiecare dintre siturile de legare k folosind secvența genomică pentru C57BL/6j și BALBc / J (SC57, k=, SBAL , k = ). Apoi, am calculat diferența scorurilor motivelor pentru C57BL6/J și BALBc/J (Dn = ) și apoi am standardizat diferențele de scor pentru fiecare motiv pe toate siturile de legare k care au avut o mutație atunci când au comparat BALBc/J cu C57BL / 6j, producând diferențe de scor standardizate pentru fiecare situs de legare (Zn = standardize(Dn) = ). În cele din urmă, am făcut apoi o predicție pentru legarea specifică tulpinii prin calcularea produsului dot al greutăților motivelor și a diferenței standardizate a scorurilor motivelor dintre c57bl6/EiJ și BALBc/J pentru situsul de legare mutant kth (XCC57-BAL = w XC).

formarea modelului TBA-2strain

pentru fiecare loci genomici care s-au intersectat cu un vârf pentru unul dintre monomerii AP-1, fie în C57BL/6j, fie în BALBc / J, Am calculat cel mai mare scor log-odds pentru fiecare dintre motivele n care vor fi incluse în model, folosind secvența genomică din ambele tulpini,obținând două seturi de scoruri de motive pentru fiecare dintre situsurile de legare k (SC57 , k=, SBAL, k = ). Au fost luate în considerare potrivirile motivelor în ambele orientări. Scorurile Log-odds mai mici de 0 au fost setate la 0. Folosind scorurile motivelor, calculăm diferența standardizată a scorurilor motivelor pe cele două tulpini, așa cum este descris în secțiunea de mai sus (Zn = ). Și astfel, caracteristicile utilizate pentru formarea modelului nostru este o matrice n de K de scoruri log-cote standardizate pe fiecare rând. Apoi, am calculat raportul log2 al numărului de citiri ChIP-seq în C57BL/6j comparativ cu BALBc / J pentru a reprezenta gradul de legare specifică tulpinii. Folosind această matrice de caracteristici și setând raportul log2 de legare între cele două tulpini ca variabilă dependentă, am antrenat greutăți pentru fiecare motiv folosind regresia liniară implementată de pachetul scikit-learn Python. Ponderile motivelor prezentate în analiza noastră sunt valorile medii pe parcursul a cinci runde de validare încrucișată, folosind 80% din date pentru antrenament și 20% pentru testare în fiecare rundă. Predicțiile pentru legarea specifică tulpinii pot fi făcute folosind greutățile calculate urmând procedura din secțiunea anterioară.

protocol cip

proteine a și G Dynabeads 50/50 mix de Invitrogen sunt dat în judecată pentru cip (10001d, 10003d). Mixul IP este format din 20 de bile de oktil/2 anticorpi de oktig la 2 milioane de cipuri de celule. Anticorpii împotriva membrilor familiei AP-1 au fost aleși pentru direcționarea regiunilor neconservate pentru a minimiza potențialul de legare nespecifică. Anticorpii sunt enumerați în tabelul suplimentar 3. Pentru preparare, mărgelele au fost spălate cu 2 0,5% BSA–PBS, apoi mărgelele-anticorp au fost incubate cu 0,5% BSA–PBS timp de cel puțin 1 h pe rotator (4 c). Se spală 2 cu 0.5% BSA-PBS, apoi omogenizat în tampon de diluare (1% Triton, EDTA de 2 mM, NaCI de 150 mM, Tris–HCl de 20 mM (pH 7,4), inhibitori de protează de 1 hectolitru). Reticulare dublă pentru cip: Media a fost decantată din celule în plăci de 10 cm, se spală o dată pe scurt cu PBS (RT). Disuccinimidil glutarat (Pierce Cat # 20593) (diluat în DMSO la 200 mM)/PBS (RT) a fost utilizat timp de 10 min. Apoi, formaldehida a fost adăugată la o concentrație finală de 1% Pentru încă 10 minute. Reacția a fost stinsă cu 1: 10 1 m Tris pH 7,4 pe gheață. Celulele au fost colectate și spălate de două ori cu PBS rece, rotindu-se la 1000 xqtg timp de 5 min. Izolarea nucleelor și Sonicare: omogenizați peletele celulare în 1 mL tampon de izolare a nucleelor (50 mM Tris-pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI și incubați pe gheață timp de 10 min. Centrifugă 2000 XTX g timp de 3 min la 4 XTX C. omogenizați nucleele în 200 XTX de tampon de liză proaspăt (0,5% SDS, 10 mm EDTA, 0,5 mm EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonicare: nucleele au fost apoi sonicate (10 milioane de celule) timp de 25 de minute într-un Biorupter (Setări = 30 s = pornit, 30 s = oprit, mediu) folosind tuburi subțiri de perete (Diagenode Cat# C30010010). După Sonicare, rotiți viteza maximă timp de 10 min la 4 C. cipul este configurat: ADN–ul sonicat a fost diluat la 5% cu 800 de tampon de diluare (1% Triton, 2 mm EDTA, 150 mm Naci, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 inhibitori de protează la sută). Un alicot este eliminat pentru probele de intrare (5%). Probele pe la 4 centimetrul C în timp ce se rotește. Spalare: ChIP se spala 1% cu TSE I (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA), 2% cu TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mm LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoxicolat, 1 mm EDTA), 1% cu TE + 0,1% Triton X-100, transfer in tub nou si apoi spălați altă dată cu te + 0,1% Triton x-100. Eluție: Eluați cu tampon de eluție de 200 unqql (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) timp de 20 min la RT, agitând pe vortex sau un nutator sau rotator. De-reticulare: se adaugă 10 xqtl de 5 m NaCI și se incubează la 65 XTC (sau cel puțin 8 h). Curățați probele folosind Zymo cip ADN curat și Concentrator. Elut în 100 unktil. Luați 40 de centicli și treceți la Protocolul de pregătire a Bibliotecii.

izolarea și fragmentarea ARN PolyA

izolarea ARN: ARN-ul a fost izolat folosind reactiv TRIZOL (Ambion cat# 15596018) și kit mini-prep ARN direct-ZOL (cat# 11-330mb). Izolarea ARN Poli-A: Utilizare 0.2 ARN total ca materie primă pentru o eficiență ideală de cartografiere și o clonalitate minimă. Se colectează 10 bile de oligo (DT) (NEB cat# s1419s) pe probă de ARN. Margelele au fost spalate de doua ori cu 1 dtbb de la 0CT (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 m LiCl, 2 mm EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Perlele au fost omogenizate în 50 de oktil din 2 oktil DTBB. S-au amestecat 50 oktql de granule cu 50 oktql ARN și s-a încălzit la 65 oktqc timp de 2 min. Bilele de ARN au fost apoi incubate timp de 10 minute la RT în timp ce se roteau. Perlele de ARN au fost apoi colectate pe un magnet și spălate cu câte 1 hectolitru fiecare cu ARN WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mm EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) și WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 m LiCl, 1 mm EDTA). Se adaugă 50 ilft Tris-HCl pH 7,5 și se încălzește la 80 ilft C timp de 2 min pentru a Eluta. Colectați ARN și efectuați oa doua colecție de margele Oligo-DT. Dupa spalarea celei de–a doua colectii, in loc de eluare a fost de 1% cu 1% tampon cu prima Catena; 250 mm Tris-HCl (pH 8,3), 375 mm KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentare: apoi se adaugă 10 xqtl din 2 XTT tampon cu prima catenă plus 10 mM DTT și se fragmentează ADN la 94 XTT C timp de 9 min. Colectați margele pe magnet și transferați eluatul care conține ARNm fragmentat într-o nouă bandă PCR. Ar trebui să recupereze ARN fragmentat de 10 xqql. Prima componenta sinteza: Am amestecat fragmentate ARN cu 0,5 µL aleatoare grund (3 µg/µL) Viața Tech #48190-011, de 0,5 µL-oligo dT (50 µM la SSIII kit), 1 µL dNTPs (10 mM Viața Tech, cat 18427088) și 0,5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Cat#AM2696) și căldură de 50 °C timp de 1 min. Puneți imediat pe gheață. Apoi am adăugat 5.8 µL ddH2O, 0.1 µL actinomicină (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL DTT (100 mM Viața Tech cat# P2325), cu 0,2 µL de 1% Tween și 0,5 µL de Exponent III și se incubează la 25 °C timp de 10 min, apoi 50 °C timp de 50 min. Șirag de mărgele curat: Am adăugat 36 unqql de RNACLEAN XP (Ampure XP) și amestecat, incubând timp de 15 min pe gheață. Margelele au fost apoi colectate pe un magnet și spălate 2 cu 75% etanol. Margelele au fost apoi uscate la aer timp de 10 min și eluate cu 10 xicli fără nuclează H2O. sinteza a doua catenă. 10 µL de adnc/ARN a fost amestecat cu 1,5 µL 10× Albastru Tampon (Enzymatics cat# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), cu 0,2 µL Rnază H (5 U/µL Enzymatics cat# Y9220L), 1 µL ADN polimeraza I (10 U/µL Enzymatics cat#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20 și 1.05 apă fără nucleaze. Reacția a fost incubată la 16 centimetrii C timp de 2,5 h. curățarea mărgelelor: ADN-ul a fost purificat prin adăugarea a 1 centimetrii seradyn 3 EDAC (Thermo 6515-2105-050250) per reacție în 28 centimetrii 20% PEG8000/2,5 M NaCl (concentrație finală de 13%) și incubarea la RT timp de 10 min. Margelele au fost apoi colectate pe un magnet și spălate 2 cu 80% etanol. Perlele au fost uscate la aer timp de 10 minute și eluate în 40 de centili de apă fără nuclează. ADN-ul este gata pentru biblioteca prep.

Protocolul de pregătire a Bibliotecii

dsDNA end repair: am amestecat 40 unqtl de ADN din protocoalele ChIP sau ARN cu 2,9 unqtl de H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase tampon (Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL de dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119), de 0,3 µL T4 ADN pol (Enzymatics P7080L), de 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) și incubate timp de 30 min la 20 °C. 1 µL de Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Termo 6515-2105-050250) în 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) a fost adăugat și incubate timp de 10 min. Curatarea margelelor: margelele au fost colectate pe un magnet si spalate 2 cu 80% etanol. Margelele au fost uscate la aer timp de 10 min și apoi eluate în 15 unktill ddH2O. dA-decantare. ADN-ul a fost amestecat cu 10.8 µL ddH2O, de 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Tampon Albastru (Enzymatics cat# B0110L), 0.6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), de 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) și incubate timp de 30 min la 37 °C. 55.8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) a fost adăugat un incubate timp de 10 min. Apoi, șirag de mărgele curat a fost făcut. Margelele au fost eluate in 14 unktil. Y-forma adaptor ligatura. Proba a fost amestecată cu 0,5 unqql dintr-un adaptor de coduri de bare BIOO (BIOO Scientific cat# 514104), 15 unqql tampon de ligare rapidă (Enzymatics cat@ l603-LC-L), 0,33 unqql 1% Tween-20 și 0.S-a adăugat ADN ligaza hc (Enzymatics L6030-HC-L) și s-a incubat timp de 15 min la RT. 7 unktil de 20% PEG8000/2,5 M NaCl și s-a incubat timp de 10 min la RT. s-a efectuat curățarea mărgelelor și s-au eluat mărgelele la 21 unktil. 10 unqql a fost apoi utilizat pentru amplificarea PCR (14 cicluri) cu primeri IGA și IGB (AATGATACGGCGACCACCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

transcrierea Nascentă a fost capturată prin secvențierea nucleară globală (GRO-seq). Nucleele au fost izolate din Tgem folosind Liza hipotonică (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mm CaCl2; 0.1% IGEPAL ca-630) și congelate flash în tampon de congelare GRO (50 mm Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 40% glicerol). Fugi. 3-5 106 nuclee BMDM au fost rulate cu NTP-uri marcate cu BrUTP cu 3 tampon nro-uri (15 mM Tris–Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mm KCl, 0,3 U/ilft de Superază în, 1,5% Sarkosil, 366 ATP-uri, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) și 1,2 CTP-uri (Roche, pentru a limita lungimea de rulare la ~40 nucleotide)). Reacțiile au fost oprite după 5 minute prin adăugarea a 500 de unkticli Trizol LS reactiv (Invitrogen), vortexat timp de 5 minute și ARN extras și precipitat conform descrierii producătorului. Peletele de ARN au fost omogenizate în 18 xtil ddH2O + 0,05% Tween (dH2O + T) și 2 xtil amestec de fragmentare (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)), apoi incubate la 70 xtil C timp de 15 min. Fragmentarea a fost oprită prin adăugarea a 2,5 unqql de 100 mm EDTA. Îmbogățirea BrdU. Îmbogățirea BrdU a fost efectuată utilizând anticorpi BrdU (IIB5) și bile AC (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot #a0215 și #C1716). Perlele au fost spălate o dată cu tampon de legare GRO (tampon salin-sodic-fosfat-EDTA 0.25 (SSPE), 0.05% (vol/vol) Tween, 37.5 mM NaCl, 1 mm EDTA) + 300 mm NaCl urmat de trei spălări în tampon de legare GRO și resuspendat ca suspensie 25% (vol/vol) cu 0.1 U/ukticl SUPERase-in. Pentru fragmentarea ARN-ului, s-au adăugat tampon de legare Gro la rece de 50 ilft și bile de anticorpi brdu echilibrați de 4 ilft și probele s-au rotit încet la 4 ilft C timp de 80 min. Margelele au fost ulterior rotite la 1000 de grame de 15 s, supernatantul a fost îndepărtat și mărgelele au fost transferate într-o coloană Mc Ultrafree Millipore (UFC30HVNB; Millipore) în 2 XFT 200 XFT GRO tampon de legare. Reacția IP a fost spălată de două ori cu un tampon de legare de 400 ilft GRO înainte ca ARN-ul să fie eluat prin incubare în 200 ilft Trizol LS (Termofisher) sub agitare ușoară timp de 3 min. Eluția s-a repetat a doua oară, 120 unqql de dH2O + T adăugat pentru a crește supernatantul și extras conform descrierii producătorului. Repararea și decaparea finală: pentru repararea și decaparea finală, peletele de ARN au fost dizolvate în tet de 8 ect (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA de 1 mM, 0,05% între 20) prin vortexare viguroasă, încălzite la 70 ect C timp de 2 min și așezate pe gheață. După o învârtire rapidă, 22 µL de Reparare master mix (3 µL 10× PNK tampon, 15.5 µL în dh2o + T, 0.5 µL SUPERase-În RNase Inhibitor (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) a fost adăugat, se amestecă și se incubează la 37 °C timp de 1 h. De a fosforila 5’end, 0.5 µL 100 mM ATP a fost adăugat ulterior și reacțiile au fost incubate timp de încă 45 de min la 37 °C (la mare ATP de concentrare potolește RppH activitate). În urma reparației finale, s-a adăugat EDTA de 2,5 ect 50 mm, reacțiile au fost amestecate și apoi încălzite la 70 ect C timp de 2 min înainte de a fi puse pe gheață. O a doua îmbogățire BrdU a fost efectuată așa cum este detaliat mai sus. Peletele de ARN au fost dizolvate în 2,75 ilft TET + 0,25 ilft Illumina TruSeq 3 ‘ Adaptor (10 ilft), încălzite la 70 ilft C timp de 2 min și așezate pe gheață. 7 din 3’master mix (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 ARN-ul ligase tampon, de 0,25 µL SUPERase-In, 1 µL T4 ARN-ul Ligase 2 trunchiat (200U; NEB)) a fost adăugat, se amestecă bine și reacții incubate la 20 °C timp de 1 h. Reacțiile au fost diluat prin adăugarea a 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, încălzită la 70 °C timp de 2 min, plasat pe gheață și o a treia rundă de BrUTP de îmbogățire a fost efectuată. Peletele de ARN au fost transferate în benzi PCR în timpul spălării cu etanol 75% și uscate. Probele au fost dizolvate în 4 lect tet (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mm EDTA, 0,05% între 20) + 1 lt 10 lt (rt). Pentru recoacerea Rtprimerului, amestecul s-a incubat la 75 centimetric C timp de 5 min, 37 centimetric C timp de 15 min și 25 centimetric C timp de 10 min. A fi conectat 5’ Illuminati TruSeq adaptor, 10 µL 5’master mix (1.5 µL în dh2o + 0.2% Tween-20, de 0,25 µL denaturated 5’TruSeq adaptor (10 µM), 1.5 µL 10× T4 ARN-ul ligase tampon, de 0,25 µL SUPERase-In, cu 0,2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, 0.5 µL T4 ARN-ul ligase 1 (5U; NEB)) a fost adăugat și reacțiile au fost incubate la 25 °C timp de 1 h. Transcrierea inversă a fost realizată cu ajutorul Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand tampon (NEB; E7421AA), de 0,25 µL SUPERase-In, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) la 50 °C timp de 1 h. După adăugarea de 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), cu 0,2 µL 100 µM înainte de grund, 2.8 µL 5 M betaină și 2 µL 10 µM individuale codul de bare grund), amestecurile au fost amplificate (95 °C timp de 3 min, (95 °C timp de 60 s, 62 °C timp de 30 s, 72 °C timp de 15 s) x13, 72 °C timp de 3 min). Reacțiile PCR au fost curățate folosind 1,5 volume de SpeedBeads (GE Healthcare) în 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Bibliotecile au fost dimensiunea selectată pe pagina / geluri TBE la 160-225 perechi de baze. Feliile de Gel au fost mărunțite prin filare printr-un tub PCR perforat de 0,5 mL plasat deasupra unui tub de 1,5 mL. S–a adăugat 150 unkticl Gel EB (0,1% LDS, 1 m LiCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,8)) și suspensia se incubează sub agitare peste noapte. Pentru a purifica ADN-ul eluat, s-a adăugat un tampon de legare a ADN-ului cu cip Zymogen de 700 il în tubul de 1,5 mL care conține felia de gel mărunțită și gelul EB, amestecat prin pipetare și suspensia transferată într-o coloană ZymoMiniElute. Probele au fost mai întâi filate la 1000 g pentru 3 min, apoi 10.000 g pentru 30 s. Debitul a fost îndepărtat, iar probele au fost spălate cu 200 unktil Zymo WashBuffer (cu EtOH). Resturile de Gel au fost îndepărtate prin flicking și coloane spălate prin adăugarea unui alt 200 unqull Zymo WashBuffer (cu EtOH). S-a eliminat curgerea, coloanele s–au uscat prin centrifugare la 14.000 hectolitri g timp de 1 min și s-a eluat ADN prin adăugarea a 20 centil Tet de secvențiere preîncălzit (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% între 20). Bibliotecile au fost secvențiate.

Western blotting

celulele au fost lizate cu tampon de liză Igepală (50 mm Tris pH 8,0, 150 mM Naci, 0.5% igepal) și concentrațiile de proteine au fost determinate cu reactivul de testare a proteinelor BioRad utilizând BSA ca standard. Proteinele au fost separate pe NuPage 4-12% geluri cu gradient Bis-Tris (Invitrogen) și transferate pe o membrană de nitroceluloză (Amersham). Membranele au fost blocate în TBS cu 0,1% Tween-20 și 5% BSA. Membranele au fost șterse cu primar indicat peste noapte la 4 centimetrii C. anticorpii secundari conjugați cu peroxidază de hrean au fost detectați utilizând ECL plus western blotting detection system (Amersham).

animale și culturi celulare

Tgem-urile au fost colectate la 3 zile după injectare de la șoareci masculi de 8 săptămâni C57Bl/6j sau BALB / cJ și au fost placate la 20 de celule 106 la 15 cm vas Petri în DMEM plus 10% FBS și 1 la penicilină–streptomicină la sută. La o zi după placare, celulele au fost suplimentate cu medii proaspete și tratate cu PBS (Veh) sau 100 ng/mL KLA timp de 1 oră și apoi utilizate direct pentru analize în aval. iBMDM sunt produse prin infecția BMDM cu un retrovirus care conține myc și Braf V600E66. Celulele imortalizate sunt apoi crescute pe parcursul mai multor săptămâni. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu standardele etice stabilite de Universitatea din California, Comitetul anual instituțional de îngrijire și utilizare din San Diego (IUCAC).

producția de Lentivirus

pLentiguide a fost modificată pentru a conține o schelă U6-bsmbi-spgRNA și un promotor CMV care conduce tagBFP2. 2 ghiduri CRISPR au fost inserate pentru fiecare țintă prin amplificarea PCR cu promotorul H1 (site-ul bsmbi/guide1/schele/promotorul H1/ghidul 2/site-ul bsmb1) pentru un total de 2 ghiduri pe virus (condus de U6 și H1) (tabelul suplimentar 4). Virusul a fost realizat cu sistemul pVSVg / ppAX2. La două zile după transfecție, mediile au fost colectate și centrifugate la 4 centi C timp de 2 ore la 20000 centi g. peletele celulare au fost reconstituite peste noapte la 4 centi C în OPTI-MEM și depozitate la -80 centi C.

producția de CRISPR KO iBMDMs

ko iBMDMs au fost produse folosind infecție lentivirală. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP au fost infectate cu MOI 100, măsurate pe 293t celule, cu Lentiblast (OZ biosciences) (5 unqql fiecare reactiv) în OPTI-mem. Aceasta a fost apoi centrifugată la 1300g timp de 1 oră la temperatura camerei. Mediile au fost apoi îndepărtate și celulele au fost suplimentate în medii de măduvă osoasă (30% celule L, 20% FBS, 1% penicilină/streptomicină în DMEM) timp de 2 zile. Celulele au fost apoi sortate pentru infecție prin exprimarea unei transgene pe secvența virală (tagBFP2).

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea experimentală sunt disponibile în Rezumatul de raportare a cercetării naturii legat de acest articol.

disponibilitatea codului