9 rolul proteinelor în nucleul catalitic Spliceosomal
Compararea mărimii snrna cu intronii mult mai mari din grupul II ridică posibilitatea ca mai multe domenii intronice din grupul II să fi fost înlocuite cu proteine în spliceozomi în timpul evoluției, dând naștere mașinilor moderne de splicing eucariote ribonucleoproteine (RNP). Deși nu există încă o corespondență unu-la-unu, este ușor posibil să se identifice proteinele spliceozomale care îndeplinesc o funcție mediată de elementele ARN în intronii din grupa II. De exemplu, un număr de proteine asociate U2 funcționează în inițierea și stabilizarea interacțiunii U2 snRNA-ramură (Fig. 6.3).5,85 la intronii din grupa II, echivalentul U2 (parte a domeniului VI) este legat covalent de situl ramurii printr-o buclă hiperstabilă de ac de păr într-un aranjament care asigură formarea și stabilitatea interacțiunii lor (Fig. 6.2). Din această perspectivă evolutivă, nu este surprinzător faptul că o mare parte din proteinele spliceozomale se asociază direct cu un snRNA, asistându-l adesea în funcția sa.5,85 cu toate acestea, multe proteine spliceosomale sunt implicate în îndeplinirea funcțiilor de reglare care nu sunt necesare în contextul unui intron de auto-îmbinare și sunt susceptibile de a fi adăugiri mai recente la complementul proteic spliceosomal.după cum s-a menționat mai sus, se crede că ultimul strămoș comun al eucariotelor a avut un spliceozom foarte evoluat, complet funcțional, care seamănă cu cele găsite în eucariotele moderne.1,2 deși acest spliceosom conține probabil mai puține componente în comparație cu cel mai mic dintre spliceosomii moderni, datele indică faptul că majoritatea componentelor cheie au fost prezente în primele versiuni ale spliceosomilor.1-4 într-adevăr, un subset al proteomului spliceozomal care include proteine asociate cu nucleul catalitic prezintă un nivel semnificativ de conservare în rândul diferitelor specii eucariote, un număr de proteine spliceozomale fiind printre cele mai conservate proteine celulare.85,86
după cum sa menționat mai sus, multe ribozime bine caracterizate sunt asociate cu proteine in vivo care își îmbunătățesc activitatea catalitică prin mai multe mecanisme cunoscute.83 acestea includ stabilizarea structurii funcționale a ARN-urilor, asistarea la legarea și poziționarea substraturilor și asistarea la legarea ionilor metalici importanți din punct de vedere funcțional. Cu toate acestea, participarea directă la cataliză nu a fost observată până în prezent pentru niciuna dintre proteinele asociate ribozimelor studiate.83,87 dacă se presupune că spliceozomul este o enzimă ARN, snrn-urile spliceozomale sunt ribozime neobișnuite în multe privințe. Poate cel mai important, acestea sunt neobișnuit de mici pentru o ribozimă care catalizează scindarea legăturii fosfodiesterice prin activarea unui nucleofil neadiacent. Alte ribozime naturale care catalizează astfel de reacții, și anume intronii din grupele I și II și Rnaza P, sunt de cel puțin două ori mai lungi decât lungimea combinată a snrn-urilor U6 și U2 umane. Aceste ribozime sunt, de asemenea, mult mai mari decât ribozimele nucleolitice care activează un nucleofil 2′-hidroxil adiacent pentru scindarea legăturii fosfodiesterice.24,88,89 se crede că dimensiunea mai mare permite acestor ribozime să se plieze în structuri complexe stabilizate prin interacțiuni terțiare multiple, care la rândul lor le permit să creeze situri active sofisticate capabile să poziționeze cu precizie locul de clivaj, ionii metalici ai sitului activ și nucleofilul la distanță pentru atac nucleofil în linie. Este posibil ca snrna-urile U6 și U2, datorită lungimii lor scurte, să formeze în cel mai bun caz o ribozimă de îmbinare ineficientă care necesită alți factori spliceozomali pentru poziționarea stabilă a elementelor situsului activ și a grupurilor de reacție.
Prp8, care este cea mai conservată proteină spliceozomală, se crede că joacă un astfel de rol în situsul activ spliceozomal. Prp8 este, fără îndoială, cea mai interesantă dintre proteinele spliceozomale, deoarece este conservată neobișnuit cu o identitate de 61% între drojdie și om.86 Cu toate acestea, are puține motive funcționale clar distincte în lungimea sa de ~ 2300 de aminoacizi, iar domeniile funcționale care au fost discernute până acum sunt degenerate și îndeplinesc probabil funcții care nu au legătură cu rolul celular al motivului fondator original.86 pe de altă parte, Prp8 joacă în mod clar un rol foarte critic în situsul activ spliceosomal. A fost reticulat la site-urile de îmbinare 5′ și 3′ și la site-ul de ramură al ARN-urilor premessenger, pe lângă snrn-urile U5 și U6, ceea ce indică faptul că este prezent în nucleul catalitic spliceosomal și contactează direct jucătorii critici în reacția de îmbinare.86,90 mai mult, s-a demonstrat că Prp8 interacționează cu mai multe proteine spliceozomale cheie, inclusiv Snu114 și Brr2 (vezi mai jos).86,91,92
mutațiile din Prp8 sunt asociate cu un spectru larg de defecte spliceozomale, inclusiv modificări ale capacității spliceozomilor de a respinge locurile de îmbinare suboptimale și suprimarea defectelor cauzate de mutații ale altor factori spliceozomali, cum ar fi snrn-urile Prp28, Brr2, U4 și U6.86,93,94 un subset de mutanți Prp8 modulează selectiv eficiența fie a primei, fie a celei de-a doua etape a îmbinării, în special în substraturile suboptime.58,86,95-97 aceste observații sunt explicate cel mai bine printr-o ipoteză care afirmă că Prp8 este implicat în stabilizarea conformațiilor situsului activ alternativ, care se exclud reciproc, care sunt fie gata pentru cataliza primului sau a celui de-al doilea pas al îmbinării și că anumiți mutanți Prp8 ar putea duce la hiperstabilizarea selectivă a uneia dintre aceste stări.58,96,98 în timp ce dovezi semnificative sugerează că Prp8 este probabil implicat în poziționarea substraturilor și stabilizarea sitului activ, în prezent nu există dovezi directe care să sugereze sau să infirme implicarea sa suplimentară în coordonarea ionilor metalici sau participarea directă la cataliza spliceozomală.
această incertitudine provine din faptul că se știe foarte puțin despre modul în care Prp8 își îndeplinește funcția. Un test inovator de screening mediat de transpozon a indicat faptul că regiuni mari de Prp8 sunt foarte sensibile la inserarea transpozonilor și funcționează probabil ca o singură unitate structurală, deși a fost posibil să se introducă transpozoni sau chiar să se împartă Prp8 în două fragmente la o serie de alte poziții fără pierderea viabilității.90,92 în afară de un semnal degenerat de localizare nucleară aproape de capătul său N și un motiv degenerat RRM (RNA recognition motif) în mijlocul proteinei, doar alte două domenii funcționale au fost identificate în această proteină lungă de aminoacizi ~ 2300.86
o variantă degenerată a domeniului MPN / Jab1 care este asociată cu enzimele deubiquitinante se găsește în apropierea terminusului C al Prp8.86 analiza structurii de înaltă rezoluție a unui fragment de Prp8 care conține acest domeniu a arătat că situsul de legare a ionilor metalici al Centrului izopeptidazei este afectat și, prin urmare, probabil că nu funcționează ca o enzimă deubiquitinantă.99.100 in vitro, un fragment de Prp8 care conține acest domeniu s-ar putea lega direct de ubiquitină cu o afinitate comparabilă cu alte proteine cunoscute care leagă ubiquitina.101 mai multe mutații cunoscute Prp8 care au perturbat îmbinarea au perturbat, de asemenea, legarea in vitro a ubiquitinei, crescând astfel posibilitatea unui rol funcțional pentru ubiquitinare în reglarea îmbinării. Foarte important, analizele proteomice au indicat faptul că mai mulți factori spliceozomali, inclusiv Sad1, Snu114, Rse1 și Prp8 în sine, sunt ubiquitinați in vivo și, în plus, proteina de bază spliceozomală Prp19 prezintă activitate E3 ubiquitin ligază in vitro.101-105 mai mult, ubiquitina joacă un rol în formarea și menținerea tri-snRNP, posibil prin modularea reglării mediate de Prp8 a funcției Brr2.102 alternativ, este posibil ca domeniul MPN/Jab1 să funcționeze ca o platformă de interacțiune proteină-proteină. O serie de mutații în Prp8 care se încadrează în acest domeniu au ca rezultat orbirea ereditară retinită pigmentară,86 și aceste mutații au slăbit interacțiunea Prp8 cu Brr2 și Snu114.99
structura de înaltă rezoluție a unui alt fragment de Prp8 a fost determinată care cuprinde o regiune foarte conservată (69% identitate de aminoacizi între drojdie și om) situată aproape de domeniul său C-terminal. Analiza structurii a relevat prezența unui deget cu ac de păr de la suta, asemănător cu cele găsite în proteinele ribozomale și un domeniu degenerat de tip RNase H.106-108 în timp ce geometria generală a motivului de tip RNase H la nivelul structurii secundare și terțiare a fost bine conservată, secvența primară a arătat un nivel de conservare mult mai scăzut și doar unul dintre cele trei reziduuri catalitice este prezent la locul activ. Reziduul conservat, un aspartat, este implicat în coordonarea a doi ioni metalici catalitici în situl activ al domeniilor canonice RNase H. Într-un studiu, mutația acestui reziduu în Prp8 în drojdie nu a dus la niciun defect de creștere detectabil, ceea ce ar putea indica redundanța sau lipsa unei funcții critice.108 într-un alt studiu, efectul său nu a putut fi examinat, deoarece mutația a indus o pliere greșită a fragmentului proteic.107 nu s-a observat nicio legare de ioni metalici de către regiunea corespunzătoare sitului activ al domeniului RNase H atunci când cristalele au fost cultivate în până la 200 mM MgCl2, indicând faptul că situl activ degenerat nu are capacitatea de legare a ionilor metalici. Mai mult, fragmentul de Prp8 care conține acest domeniu a prezentat o capacitate foarte slabă de legare a ARN-ului, cu un Kd de la 20 la peste 200 la 200 la sută în funcție de speciile de ARN testate.106-108 deși fragmentul a arătat o afinitate foarte scăzută pentru ARN-urile de legare, a arătat o preferință pentru ARN-urile duplex de legare care conțin joncțiuni cu patru căi.108 în spliceozomii umani activi, se preconizează că snrn-urile U2 și U6 formează o astfel de structură.53,69 ceea ce a făcut ca acest domeniu asemănător Rnazei H să fie deosebit de interesant a fost faptul că aminoacizii corespunzători sitului său activ sunt poziționați adiacent reziduurilor din Prp8 care s-au dovedit anterior că se leagă la situl de îmbinare 5′ în spliceozomii precatalitici.109 cu toate acestea, eficiența formării acestei legături încrucișate a fost redusă pe măsură ce spliceozomii precatalitici au progresat pentru a deveni complecși spliceozomali activi catalitic.109 scăderea observată a eficienței reticulării ar putea fi interpretată pentru a indica faptul că această interacțiune este perturbată în spliceozomii activi. Alternativ, interacțiunea poate persista, dar formarea legăturii încrucișate în sine este eliminată din cauza unei modificări minore a mediului reziduurilor reticulate. Dacă acest domeniu degenerat de tip RNase H este într-adevăr poziționat în apropierea sitului de îmbinare 5′ în spliceozomi activi catalitic, este posibil să participe la stabilizarea conformației active a snrna-urilor, poziționarea substraturilor în situl activ și/sau coordonarea ionilor metalici catalitici. În timp ce domeniul în sine nu poate lega ARN sau ioni metalici, este posibil ca în prezența altor elemente de sit activ să poată face parte din substrat sau buzunare de legare a ionilor metalici. În ciuda acestor posibilități interesante, rolul Prp8 în cataliza spliceozomală rămâne incert.