bacterii reducătoare de sulfat în fecalele umane și asocierea lor cu boli inflamatorii intestinale

rezumat

am căutat bacterii reducătoare de sulfat în fecalele a 41 de persoane sănătoase și 110 pacienți dintr-o unitate Hepato-Gastro-Enterologică folosind un mediu lichid specific (Test-kit Lab Oktargeux, Compagnie Fran Inktaise de G Oktotermie, ORL Inktans, Franța). Cei 110 pacienți au fost separați la 22 de pacienți cu afecțiuni inflamatorii intestinale și 88 de pacienți internați pentru alte afecțiuni ale tractului digestiv inferior (n=30) sau superior (n=58). Bacteriile reducătoare de sulfat au fost izolate de la 10 persoane sănătoase (24%), 15 pacienți care prezintă boli inflamatorii intestinale (68%) și 33 de pacienți cu alte simptome (37%). A PCR multiplex a fost conceput pentru identificarea desulfovibrio piger (fost Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis și Desulfovibrio desulfuricans și aplicat izolatelor de mai sus. Tulpinile de bacterii reducătoare de sulfat au constat din D. piger (39 izolate), D. fairfieldensis (19 izolate) și D. desulfuricans (un izolat). Prevalența D. piger a fost semnificativ mai mare la pacienții cu boală inflamatorie intestinală (55%) comparativ cu persoanele sănătoase (12%) sau pacienții cu alte simptome (25%) (P<0,05).

1 Introducere

boala Crohn (CD) și colita ulcerativă (UC) sunt boli cronice inflamatorii intestinale (IBD) de etiologie necunoscută, dar sunt susceptibile să se bazeze pe factori de mediu, genetici și imuni . A fost propusă o origine infecțioasă și multe microorganisme au fost implicate în absența unor argumente convingătoare. Cu toate acestea, în ambele sindroame, inflamația intestinală răspunde la antibioterapie. La modelele animale de colită cronică, flora luminală este un cofactor esențial pentru apariția bolii . Acest lucru poate explica interesul reînnoit pentru rolul florei intestinale ca cauză a acestor tulburări .bacteriile reducătoare de sulfat (SRB) sunt microorganisme anaerobe care conduc reducerea diferită a sulfatului pentru a obține energie, rezultând eliberarea unei cantități mari de sulfură. Ele sunt de obicei izolate din surse de mediu, dar sunt prezente și în tractul digestiv al animalelor și al oamenilor. As Desulfomonas pigra a fost reclasificat ca pieptene desulfovibrio piger. nov. , izolatele umane ale SRB constau aproape exclusiv din specii Desulfovibrio . Descoperirile recente sugerează că SRB poate avea un rol în bolile umane. Acestea au fost asociate cu severitatea clinică a parodontitei umane și izolate de abcese profunde (abdominale sau cerebrale), sânge sau urină . În aceste setări, majoritatea tulpinilor au fost identificate ca Desulfovibrio fairfieldensis, o specie nouă propusă recent , prin secvențierea genei ARN ribozomale 16S (16S ADNR). Desulfovibrio desulfuricans, specia tip a genului Desulfovibrio, a fost, de asemenea, izolată de exemplarele umane . Implicația SRB în IBD a fost sugerată ca produs final metabolic, hidrogen sulfurat, este un compus citotoxic . Acest compus poate acționa printr-o inhibare a oxidării butiratului, principala sursă de energie pentru colonocite. Afectarea funcțiilor epiteliului intestinal ar duce la moartea celulelor și la inflamația cronică. Cu toate acestea, speciile de SRB asociate cu IBD nu au fost încă identificate. Identificarea lor ar permite să se caute factori de virulență, precum și susceptibilitatea lor la agenți antimicrobieni.

în laboratoarele medicale, SRB sunt rareori izolate din probele umane din cauza unei creșteri lente. Coloniile apar după mai mult de 3 zile de incubație și nu sunt observate, fiind supraaglomerate de flora însoțitoare, cu excepția cazului în care sunt speciile dominante sau unice prezente. Astfel, căutarea lor în fecale este dificilă dacă nu se utilizează un mediu specific. Astfel de medii conțin de obicei un compus organic (donator de electroni și sursă de carbon), sulfat (acceptor de electroni), fier și un agent reducător. Creșterea SRB în medii de cultură specifice este ușor de detectat printr-o înnegrire a mediului datorită producției de hidrogen sulfurat (H2S) rezultând formarea unui precipitat de sulfură feroasă. Odată izolat din probe clinice, identificarea la nivel de specie poate fi dificilă. De exemplu, nu este posibilă diferențierea D. fairfieldensis și D. desulfuricans prin teste fenotipice. Astfel, amplificarea genelor este un instrument valoros pentru a realiza o astfel de identificare.

scopul principal al acestui studiu a fost de a determina ce specie de Desulfovibrio poate fi asociată cu IBD, dacă există. În acest scop, s-a utilizat un mediu lichid specific (Test-kit Lab Oktsge, Compagnie Fran Oktsaise de G Oktothermie, ORL Oktsans, Franța) pentru creșterea SRB din fecalele persoanelor sănătoase și ale pacienților internați în unitatea de Hepato-Gastro-enterologie a Centrului Hospitalier et Universitaire de Nancy, Franța. A fost conceput un PCR multiplex pentru identificarea izolatelor la nivel de specie.

2 Materiale și metode

2.1 pacienți

fecale de 41 de persoane sănătoase (17 bărbați și 24 de femei; vârsta medie 38 ani, Interval 1-101 ani) și 110 pacienți (67 bărbați și 43 femei; vârsta medie 57 ani, Interval 14-100 ani) din unitatea Hepato-Gastro-enterologie a Centrului Hospitalier et Universitaire de Nancy, Franța, au fost colectați. Persoanele sănătoase consultate consecutiv pentru un control. Nu s-a găsit niciun microorganism patogen în fecalele lor. Persoanele sănătoase și pacienții nu au avut nici o administrare de antibiotice în luna anterioară obținerii probei. Pacienții au fost separați în trei grupuri: IBD (N=22) a inclus 17 CD și cinci UC; alte boli ale intestinului inferior (n=30) au inclus 23 de pacienți care prezentau simptome ușoare sau moderate, cum ar fi dureri abdominale, tulburări de tranzit intestinal și rectoragie și șapte pacienți cu cancer de colon; bolile tractului digestiv superior (n=58) au inclus calculi biliari, ciroză, carcinom hepatocelular, tumori gastrice și pancreatice. IBD au fost diagnosticate pe baza constatărilor clinice, endoscopice și histologice. Majoritatea pacienților cu IBD au prezentat o boală activă (Tabelul 1).

2.2 detectarea și enumerarea SRB

un gram de fecale a fost amestecat cu 4 ml de tampon salin tampon fosfat și centrifugat (3000 rpm, 5 min). Un mililitru de supernatant a fost inoculat imediat într-un mediu lichid (Test-kit Lab Oktsge, Compagnie Fran Oktsaise de G Okthermie, ORL Oktsans, Franța) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, kiturile de testare de la laboratorul de teste de la incremental sunt compuse din flacoane ce contin 9 ml dintr-un mediu specific (compusi organici: lactat si acetat, Agent reducator: citrat de titan) conditionate anaerob pentru detectarea SRB. Se inoculează cu o seringă printr-un capac de cauciuc. Acest mediu limpede și incolor a fost conceput inițial pentru detectarea SRB din probele de mediu. A fost comparat cu mediul solid e al Postgatului utilizat în mod obișnuit (compus organic: lactat, agenți reducători: acid ascorbic și acid tioglicolic) , inoculat în paralel sub atmosferă anaerobă. SRB au fost enumerate folosind tuburi lungi și înguste umplute cu ultimul mediu și inoculate cu diluții zecimale ale fecalelor. Toate mediile inoculate au fost incubate la 37 C timp de 2 luni. Prezența SRB a fost constatată prin formarea unui precipitat negru (sulfură feroasă) în medii lichide și prin apariția coloniilor negre în medii solide.

2.3 proiectarea primerilor PCR

secvențele ADNR 16S ale tulpinilor Desulfomonas și Desulfovibrio disponibile în baza de date GenBank au fost comparate folosind software-ul Sequence Navigator, versiunea 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Statele Unite ale Americii). A permis proiectarea a șase primeri pentru identificarea prin PCR a SRB izolat anterior de oameni, respectiv legat de D. piger (fost Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577t, D. desulfuricans MB ATCC 27774 și D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 și D. desulfuricans MB au fost diferențiate deoarece secvențele ADNR 16S ale acestor tulpini prezintă o diferență de 3%. Primerii au fost 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG a-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT Cat Cat CCT AC-3′) și P687-R (5′-gat ATC Tac GGA TTT CAC TCC Tac ACC-3′) (Tabelul 2). Specificitatea acestor primeri a fost verificată pe toate secvențele bacteriene disponibile din Baza de date GenBank folosind programul Blast, versiunea 2.0 (Centrul Național pentru Informații Biotehnologice, Bethesda, MD, SUA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, două tulpini înrudite cu D. desulfuricans MB și opt tulpini identificate ca D. fairfieldensis)au fost utilizate ca martor pozitiv. Sensibilitatea PCR a fost evaluată cu diluții de suspensii de tulpini bacteriene cuantificate. Specificitatea PCR a fost verificată cu controale negative incluzând tulpini de tip (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) și tulpini clinice intestinale comune aparținând următoarelor specii: Bacteroides fragile, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniform, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, bacterii inofensive, Enterobacter Imperiul roman, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium mic, Eubacterium lipicios, Fusobacterium nucleatum, Copenhaga a canalului, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus mare, Proteus minunat, Proteus comun, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis și Streptococcus bovis.

la sfârșitul perioadei de incubare, toate cele 151 de Test-kit-uri inoculate de laborator, de la incremental, au fost verificate cu ajutorul PCR multiplex. Extractele de ADN au fost obținute din medii de cultură de 500 ilqtl, după centrifugare și omogenizare în tampon TE (10 mM Tris–HCl, 1 mm EDTA, pH 8). Pe scurt, celulele au fost lizate folosind lizozim succesiv (3 mg ml−1), SDS (1%, g/v) și proteinază K (0,25 mg ml−1). După o incubare peste noapte la 37 C, ADN-ul a fost extras prin metoda standard fenol/cloroform/alcool izoamilic. Fiecare amestec PCR de 50-unqql conținea 5 unqq de extract de ADN (aproximativ 50 ng de ADN) și cantități finale de 0,4 unqq din fiecare primer, 0,8 mM din fiecare deoxinucleozid trifosfat (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Germania), 0,4 mM tampon Tris–HCl, 1,5 mM MgCl2 și 1,5 U de ADN polimerază Taq (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, MAREA BRITANIE). Toate reacțiile au fost efectuate utilizând sistemul GENEAMP PCR 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, SUA). O etapă inițială de denaturare de 94 XTX C timp de 4 min a fost urmată de 30 de cicluri de denaturare (94 xtxc, 1 min), recoacere (55 xtxc, 1 min) și extensie (72 xtxc, 2 min) și cu o extensie finală (72 xtxc, 5 min). Controalele Negative (apă în loc de extract de ADN) și pozitive (extract de ADN D. fairfieldensis) au fost incluse în fiecare rulare. Produsele amplificate au fost rezolvate prin electroforeză în 1,5% (g/v) geluri de agaroză conținând bromură de etidiu (1,6 mg ml−1). O scară ADN de 100 bp a fost utilizată ca marker de dimensiune (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, SUA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. desulfuricanii MB și D. fairfieldensis au fost identificați printr-o bandă de 255 -, 255 -, 396-și, respectiv, 534-bp. D. piger și D. desulfuricans Essex 6 au fost diferențiate în continuare prin teste PCR separate folosind primerii lor specifici. Pentru probele negative, s-a efectuat amplificarea ADNR 16S utilizând primerii de consens 27f și 1525r pentru a verifica absența inhibării PCR de către contaminanți.

3 rezultate

3.1 detectarea și enumerarea SRB

la persoanele sănătoase și în conformitate cu criteriile de mai sus, SRB au fost găsite în 10 fecale (24%) atât cu laboratorul de testare-Kit-uri, cât și cu mediul Postgate. La pacienții din unitatea Hepato-Gastro-enterologie, SRB au fost crescuți din 42 de fecale folosind mediul Postgate. Trei probe suplimentare s-au găsit pozitive cu laboratorul de testare-Kit-uri de la olfactiv. Astfel, dintre cei 110 pacienți studiați, SRB au fost detectați prin cultură la 45 de pacienți (41%). Trei probe suplimentare au dat rezultate echivoce cu laboratorul de testare-Kit-ul de laborator de testare (prezența unui precipitat maroniu închis). Timpii medii de detecție a creșterii SRB au fost de 2 și 6 zile utilizând Laboratorul de testare-Kit-uri de la Ecxux (interval 1-11 zile) și, respectiv, mediul Postgate (interval 3-39 zile). Numărul mediu de SRB în fecalele persoanelor și pacienților sănătoși a fost de 105 g−1 (interval 102-109 g−1). Astfel, numărul de SRB nu a fost legat de starea clinică a pacienților.

3.2 identificarea SRB prin PCR multiplex

sensibilitatea testului PCR multiplex a fost de 100 bacterii pe ml. Specificitatea sa a fost constatată prin absența reacțiilor încrucișate între cele patru genospecii diferențiate. Fiecare control pozitiv a fost găsit pozitiv numai cu setul corespunzător de grunduri. Toate tulpinile utilizate ca martor negativ pentru verificarea specificității, inclusiv tulpinile de tip D. gigas și D. vulgaris, au dat rezultate negative cu cele patru seturi de primeri. Specificitatea reacțiilor a fost confirmată în continuare prin secvențierea produselor amplificate. Secvențele obținute corespundeau întotdeauna celor așteptate. Pentru probele SRB-negative prin PCR, amplificarea ADNR 16S a permis eliminarea posibilității de inhibare a PCR-urilor de către contaminanți.

la pacienții din unitatea Hepato-Gastro-enterologie, cele 45 de fecale pozitive și cele trei fecale echivoce au dat rezultate pozitive prin PCR. Acestea corespundeau lui D. piger (n=33), D. fairfieldensis (n=14) sau ambelor (N=1). Nu a fost evidențiat niciun D. desulfuricans (Tabelul 3). Baloanele negative pentru Cultură au fost, de asemenea, negative prin PCR.

3.3 relația speciilor Desulfovibrio cu IBD

distribuția speciei nu a diferit semnificativ atunci când s-au comparat indivizii sănătoși și pacienții cu boli intestinale neinflamatorii. D. piger a fost abia mai răspândită decât D. fairfieldensis. În schimb, la pacienții cu IBD, D. piger a fost de 4 ori mai frecvent decât D. fairfieldensis. Această diferență a fost vizibilă în special pentru CD, deoarece pacienții cu IBD au constat în principal din pacienți cu CD. În plus, prevalența D. piger a fost semnificativ mai mare la pacienții spitalizați pentru IBD comparativ cu persoanele sănătoase sau pacienții spitalizați pentru alte patologii (P<0,05). Nu a existat nicio legătură între stadiul bolii și prezența SRB. Terapia nu a modificat rata de izolare a acestor bacterii.

4 discuție

prezența SRB în tractul intestinal al animalelor și al oamenilor a fost recunoscută de mult timp, deși identificările la nivel de specie au fost rareori efectuate. Rezultatele noastre confirmă faptul că aceste bacterii sunt locuitori comuni ai tractului intestinal al oamenilor. Majoritatea studiilor privind SRB intestinal de la pacienții cu IBD s-au bazat pe analiza microbiologică bazată pe cultivare a probelor fecale și, prin urmare, au identificat SRB la nivelul genului . Cu toate acestea, studii recente au sugerat că rolul posibil al SRB în patogeneza IBD poate fi legat de diferențele fiziologice și/sau filogenetice dintre tulpinile SRB . Astfel, am conceput un PCR multiplex pentru a identifica aceste bacterii la nivel de specie. Având în vedere dificultatea izolării și raritatea căutărilor specifice, prevalența SRB în probele clinice umane este cu siguranță subestimată. Laboratorul de testare-Kit-uri de la Inox, dezvoltat pentru detectarea SRB din probele de mediu, s-a dovedit a fi un mediu adecvat pentru detectarea SRB din fecale, precum și din fluidele corporale (Loubinoux, rezultat Nepublicat). Acesta a fost demonstrat de către producător să crească tulpini de mediu de SRB, cum ar fi D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034t și Desulfobulbus propionicus DSM 2032t. În mâinile noastre, s-a dovedit a fi mai sensibil decât mediul Postgate utilizat în mod obișnuit, deoarece șase izolate suplimentare de Desulfovibrio au fost detectate la pacienți. În ciuda florei abundente de însoțire, Laboratorul de testare-Kit-ul de testare a permis creșterea rapidă a SRB din specimenele de scaun, deoarece timpul mediu de detectare a fost de 2 zile (față de 6 zile în mediul Postgate). Acest lucru poate fi legat de calitatea mediului, dar și de modul de inoculare a probelor care asigură menținerea anaerobiozei stricte. În comparație cu mediul Postgate, adăugarea de acetat la lactat lărgește spectrul de detecție pentru a include acetat care metabolizează SRB în creștere lentă, cum ar fi Desulfobacter spp. Mai mult decât atât, prezența citratului de titan, care este un agent reducător foarte eficient (potențialul redox al Laboratorului Test-kit de la -600 MV), permite o detecție mai rapidă a majorității tulpinilor de SRB.

este posibil ca unele tulpini de SRB să nu fi fost depistate de laboratorul de truse de testare, fiind supraaglomerate de flora însoțitoare sau din cauza unui număr redus de probe. Cu toate acestea, Laboratorul de testare-Kit-uri de la Inox este adaptat la creșterea majorității SRB, iar toate baloanele pozitive au fost identificate prin PCR ca D. piger, D. fairfieldensis sau D. desulfuricans. În ciuda timpului de incubație de 2 luni, nu a fost evidențiată nicio specie suplimentară. Astfel, este posibil ca descoperirile noastre să corespundă florei umane reale constând aproape exclusiv din D. piger și D. fairfieldensis. D. desulfuricans a fost izolat o dată și a fost descris și la om într-un studiu anterior , dar este probabil mai puțin frecvent în tractul intestinal. În cele mai multe cazuri, D. piger și D. fairfieldensis s-au exclus reciproc. O asociere a ambelor specii a fost observată o singură dată într-un caz de cancer de colon. Pentru a confirma apariția aproape non-suprapusă a D. piger și D. fairfieldensis, cinci colonii de SRB cultivate în mediul Postgate Solid au fost identificate prin PCR pentru fiecare test pozitiv-Kit de laborator Ecquxe. În fiecare caz, același rezultat a fost obținut și cele cinci colonii au aparținut aceleiași specii (datele nu sunt prezentate). De asemenea, am efectuat o urmărire a 10 pacienți (cinci SRB-pozitivi și cinci SRB-negativi) timp de 2 luni, iar scaunele au fost cultivate în fiecare săptămână. Pentru fiecare pacient, același rezultat (SRB-pozitiv sau SRB-negativ) a fost obținut cu toate probele (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, ar fi interesant să urmăriți pacienții cu IBD pe o perioadă mai lungă de timp pentru a determina dacă activitatea bolii are o consecință asupra populației SRB.

D. desulfuricans este de obicei izolat de mediul înconjurător și a fost, de asemenea, considerat ca fiind cea mai răspândită specie de Desulfovibrio la om până la descrierea recentă a D. fairfieldensis. Astfel, putem fi surprinși de apariția foarte scăzută a D. desulfuricanilor în populația noastră. Până în prezent, D. piger și D. fairfieldensis au fost izolate exclusiv din probe umane. Astfel, rezultatele noastre arată că ambele specii pot fi specifice tractului intestinal uman. Cu toate acestea, acest lucru rămâne să fie determinat de căutarea specifică a acestor bacterii în alte nișe ecologice. D. piger a fost descris o singură dată și a fost considerat o descoperire neobișnuită la om. Rezultatele noastre indică faptul că poate fi cel mai frecvent SRB din tractul intestinal. Cu toate acestea, această specie nu a fost niciodată descrisă în procesele infecțioase. Dimpotrivă, D. fairfieldensis, aparent mai puțin frecvent în fecalele umane, a fost izolat în afara lumenului colonului din sânge și colecții septice . Astfel, D. fairfieldensis poate avea proprietăți invazive suplimentare în comparație cu alte specii de Desulfovibrio, ceea ce ar explica recuperarea sa din probe clinice. Interesant, în seria noastră de pacienți, prevalența D. piger în fecale este semnificativ mai mare la pacienții spitalizați pentru IBD (mai ales CD) decât la persoanele sănătoase sau la pacienții spitalizați pentru alte patologii. Acest lucru poate avea două explicații: fie D. piger are caracteristici fiziologice care provoacă apariția leziunilor și/sau participă la perpetuarea proceselor inflamatorii cronice, sau colonizarea de către această specie este favorizată de condițiile locale la pacienții cu IBD. Asocierea SRB cu IBD a fost deja descrisă . D. piger nu a mai fost luat în considerare de la prima sa descriere din 1976 . Astfel, constatarea că această bacterie, considerată o specie nepatogenă, este un locuitor comun al tractului intestinal uman și cea mai răspândită specie de SRB la pacienții cu IBD este surprinzătoare. Trebuie efectuate studii suplimentare pentru a elucida modul în care D. piger poate fi implicat în aceste procese inflamatorii cronice.

mulțumiri

această lucrare a fost sprijinită în parte de Compagnie Fran Inktaise de G Oktothermie (ORL Inkttans, Franța) și de un Grant FCT POCTI 36562/ESP / 2000 către ICP. Suntem îndatorați regretatului Dr. Wee Tee (Universitatea din Melbourne, Australia) pentru furnizarea cu amabilitate a patru tulpini de D. fairfieldensis (inclusiv tulpina ATCC 700045) și, de asemenea, prof.D. Raoult (Universitatea din Marsilia, Franța) pentru furnizarea unei tulpini de D. fairfieldensis. Îi mulțumim lui D. Meng și A. M. Carpentier (Laboratoire de bact Oustriologie-Virologie UMR CNRS 7565) pentru asistența tehnică excelentă, Dr.A. Dao și prof. B. Fortier pentru furnizarea de fecale de la persoane sănătoase, precum și asistentele medicale ale unității Hepato-Gastro-enterologie pentru bunătatea lor.