blocarea dublă a CD47 și HER2 elimină celulele cancerului de sân radiorezistent

linii celulare

cancerul de sân uman MCF-7, MDA-MB-231, bt474, BT549, liniile celulare SKBR3, glioblastomul U251 și cancerul de colon liniile celulare HCT116 au fost achiziționate de la ATCC. Celulele MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549 și U251 au fost menținute în mediu DMEM suplimentat cu 10% FBS, iar celulele SKBR3 menținute în mediu RPMI-1640 cu 10% FBS. Celulele HCT116 au fost menținute în mediul 5a al McCoy cu 10% FBS. Liniile celulare MCF7/C6 și MDA-MB-231/C5 care au fost clonate din fracțiunile supraviețuitoare ale celulelor MCF7 și MDA-MB-231 după iradiere repetată; celulele stem HER2-supraexprimând cancerul de sân (HER2+/CD44+/CD24−/BCSCs scăzute) au fost izolate din MCF7/C626. Celulele 4T1 de cancer mamar triplu-negativ de șoarece au fost menținute în mediu DMEM cu 10% FBS. Monocitul uman THP-1 a fost cultivat în mediu RPMI-1640 formulat ATCC suplimentat cu 10% FBS, HEPES de 15 mM, 4,5 g/L glucoză și 2-mercaptoetanol la o concentrație finală de 0,05 mM. șoarece m brut 264.7 celule au fost cultivate în mediu DMEM cu 10% FBS urmând metoda de cultură ATCC. Toate liniile celulare au fost testate contaminarea cu mycoplasma negativă cu MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Catalog # 302108).

plasmide și reactivi

vectorul luciferazei controlat de promotorul CD47 a fost construit prin clonarea regiunii promotorului CD47 uman (-1554 nt) în plasmida pgl2-bazică din situsurile KpnI / Hind III. Ștergerea siturilor de legare NF-kB presupuse (TGGAAGCT-764-757) a fost efectuată utilizând un kit de mutație rapidă (Stratagene, La Jolla, CA). Secvențele de grund utilizate: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (Catalog # S1028) a fost achiziționat de la Selleckchem. Anticorpul anti-CD47 (B6H12) pentru IHC, ICC și western blot a fost achiziționat de la Santa Cruz (Catalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC pentru citometrie în flux a fost achiziționat de la bd Biosciences (Catalog # 556045). Anticorpul anti-uman CD47 (B6H12) pentru testul de fagocitoză a fost extras din hibridoma B6H12.2 (ATCC-HB-9771-x-x). Anticorpul CD47 anti-șoarece pentru inhibarea tumorii in vivo a fost extras din miap301 hybridoma furnizat de Dr.William Frazier (școala de Medicină a Universității Washington). Anticorpul anti-CD11b pentru colorarea IHC a fost achiziționat de la Invitrogen (Catalog # MA5-17857). Anticorpul monoclonal anti-tubulină de șoarece pentru western blot a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Catalog # T6074). Anticorpul monoclonal anti-actină de șoarece pentru western blot a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Catalog # a5441). Anti-HER2/ERBB2 (Catalog # 29d8) anticorp pentru colorarea IHC și western blot a fost achiziționat de la cell Signaling Technology (Catalog # 2165). Anticorpul anti-HER2-APC pentru analiza citometriei în flux a fost achiziționat de la bd Biosciences (Catalog # 340554).

imunoblotting

proteinele din celule sau țesuturile tumorale au fost extrase în tampon de liză RIPA (Pierce) suplimentat cu cocktail de protează și inhibitor de fosfatază (semnalizare celulară). Concentrația de proteine a fost determinată folosind testul BCA (Pierce). Lizații au fost apoi denaturați și probele care conțineau 30 de proteine de hectolitru au fost supuse electroforezei în 10% gel SDS-poli-acrilamidă, urmată de transferul în membrane de difluorură de poliviniliden (Bio-Rad). După blocarea cu 5% lapte uscat degresat, membrana a fost expusă la anticorpul primar și incubată la 4 centimetric C peste noapte. Bloturile au fost vizualizate prin etichetare cu anticorpi secundari cuplați cu HRP (Sigma-Aldrich) și incubare cu Amersham ECL western blotting detection reactiv (Catalog # RPN2106). Blots au fost dezvoltate pe un dezvoltator Konica SRX101A și cuantificate cu ImageJ.

analiza citometriei în flux

celulele colectate au fost clătite cu PBS conținând 0,5% BSA în PBS, iar peletele celulare au fost incubate cu anticorpi primari marcați cu fluorescență la 37 CTC timp de 30 min, urmate de spălare de trei ori cu 0,5% BSA / PBS. Toți anticorpii au fost titrați pentru optimizarea stării înainte de aplicarea experimentului. Analiza citometriei în flux a fost efectuată cu ajutorul citometrului FACS Canto II (BD), iar analiza ulterioară a fost efectuată cu ajutorul software-ului FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, SUA). Strategiile de închidere s-au bazat pe proprietățile FSC și SSC și au fost configurate pentru populațiile de celule pozitive în canalele FITC, APC.

țesuturile cancerului de sân uman

țesuturile proaspete congelate HER2 pozitive și negative pentru cancerul de sân au fost furnizate de UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665 și IRB # 218204) finanțat de UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) acordat de Institutul Național al cancerului (NCI P30CA093373) cu toate informațiile despre pacient blocate, cu excepția rezultatelor diagnosticului. Probele patologice suplimentare ale cancerului de sân uman, inclusiv secțiunile necolorate de 4-centimetri grosime ale cancerului de sân primar asociat cu parafină fixă cu formalină (FFPE) și cancerele de sân recurente, au fost obținute de la Departamentul de patologie, Universitatea de Stat din Ohio, cu aprobarea IRB de cercetare (#2002h0089).

imunohistochimie (IHC)

colorarea imunohistochimică s-a făcut pe secțiuni de țesut FFPE cu grosimea de 4-mm. Pe scurt, diapozitivele au fost deparaffinizate și rehidratate, iar antigenii au fost recuperați timp de 40 min într-un tampon citrat (pH 6,1) la 95 C. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost blocată cu 3% soluție H2O2. Incubarea primară a anticorpilor s-a făcut la 4 CTC peste noapte, urmată de Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) la RT timp de 30 min conform instrucțiunilor producătorului. Produsele de reacție au fost detectate folosind kitul de substrat peroxidază și contracarate cu hematoxilină (laboratoare Vector). Doi patologi seniori au fost responsabili de diagnosticul cancerului de sân clinic și de evaluarea tumorilor experimentale. Expresia CD47 a fost evaluată utilizând atât intensitatea colorării, cât și procentul de celule colorate. Intensitatea colorării a fost clasificată ca 0: negativ; 1: slab; 2: moderat; 3: puternic. Expresia ridicată a fost definită ca intensitate puternică de colorare în mai mult de 25% din celulele tumorale; expresia medie a fost intensitate moderată de colorare în mai mult de 25% din celulele tumorale; expresia scăzută a fost intensitatea slabă a colorării în mai mult de 25% din celulele tumorale sau colorarea moderată în <25% din celulele tumorale folosind ghidurile ASCO-CAP63 a fost utilizat pentru interpretarea imunohistochimiei HER2 (IHC), iar expresia proteinei HER2 a fost marcată ca IHC negativ 0 (fără colorare sau colorare cu membrană care este incompletă și este slabă/abia perceptibilă și în limita a 10% din celulele tumorale invazive) sau IHC negativ 1+ (colorare incompletă a membranei care este slabă/abia perceptibilă și în >10% din celulele tumorale invazive); echivoce IHC 2+ (colorație circumferențială a membranei care este incompletă și/sau slabă/moderată și în >10% din celulele tumorale invazive; și sau colorație completă și circumferențială a membranei care este intensă și în interiorul a 10% din celulele tumorale invazive); IHC 3 + pozitiv (colorație circumferențială a membranei care este completă, intensă în mai mult de 10% din celulele tumorale invazive). Dacă rezultatele au fost echivoce (2+), testarea reflexă a fost efectuată utilizând hibridizarea in situ (ISH). În Detectarea expresiei CD47 a tumorilor iradiate in vivo, tumorile de șoarece tratate au fost îndepărtate și fixate în paraformaldehidă 4% în PBS timp de 24 de ore. exemplarele au fost deshidratate cu etanol în serie (70%, 95% și 100%) timp de 48 de ore înainte de a fi încorporate în soluția de parafină (Polysciences).

Imunocitochimie (ICC)

celulele au fost însămânțate pe capace rotunde și crescute la confluență de 60-80%, urmate de clătire cu PBS, fixare în paraformaldehidă 4% (pH 7,2) și permeabilizare cu 0,1% Triton X-100 în PBS. Celulele au fost apoi incubate într-o soluție de blocare timp de 15 minute înainte de incubare cu anticorpul primar peste noapte la 4 centicc cu diluții 1:250. Celulele au fost incubate cu anticorpi secundari conjugați TR sau FITC diluați 1: 1000 în soluția de blocare timp de 1 oră la temperatura camerei în întuneric și analizați cu microscopie confocală.

identificarea proteinelor antigenice asociate radiațiilor

șoarecele C57/B6 a fost utilizat ca gazdă de imunizare cu 5 celule 106 mcf7 / C6 în 0.1 ml volum injectat la baza cozii sau a piciorului pe șoarece, urmat de creșterea cu același volum de celule la a 14-a zi. În ziua 5-7 după a doua provocare, șoarecii au fost eutanasiați și serul a fost colectat pentru a detecta moleculele antigenice exprimate în celulele BC radiorezistente. Pentru a distinge Raap de moleculele nespecifice exprimate în celulele epiteliale normale ale sânului și celulele MCF7 de tip sălbatic, a fost efectuată o procedură pre-curată cu serul brut prin următoarele etape. Două milioane de celule epiteliale normale ale sânului uman MCF10A au fost preparate într-o soluție care conține EDTA/PBS de 1 mm fără tripsină pentru a evita digerarea unor proteine sensibile, urmată de clătirea cu PBS de două ori. Celulele au fost granulate și apoi slăbite prin atingerea fundului tubului, urmată de adăugarea a 1 ml anti-seruri de șoarece și rotirea la 4 centimetric C timp de 2 ore. amestecul a fost apoi centrifugat la 9391 centimetric g timp de 5 min la 4 centimetric C și supernatanții au fost colectați, care a fost repetat o dată. Primul antiser curățat a fost curățat în continuare prin incubare cu celule MCF7 de tip sălbatic folosind aceleași proceduri și repetat de șase ori. Antiserul purificat final a fost apoi testat de western blot împotriva lizatului proteic din celulele MCF10A, celulele MCF7, MCF7/C6 și celulele RD-BCSC care au fost sortate după markerii celulelor stem ale cancerului de sân HER2+/CD44+/ CD24− precum și aldehidă dehidrogenază (ALDH)64. CD47 și HER2 împreună cu alte Raap din celulele BC radiorezistente au fost identificate prin western blots sau prin imunoprecipitarea proteinelor membranare purificate din celulele RD-BCSC, iar fracțiunile eluate au fost analizate prin LC/MS.Raap-urile membranare rezultate au fost grupate cu un număr de proteine și categorii funcționale proteice.

editarea CRISPR a HER2 și CD47

sgrn-urile au fost proiectate urmând instrucțiunile publicate de software-ul de proiectare CRISPR al Dr.Zhang Lab (http://crispr.mit.edu) și protocolul stabilit care a fost descris în publicația anterioară65. Patru Oligos au fost proiectate corespunzător sgrn-urilor umane au fost sintetizate și clonate în lentiCRISPR v2 vector urmând Zhang Lab Gecko protocolul de amplificare a Bibliotecii reunite. Pentru a minimiza posibilitatea direcționării nespecifice, au fost sintetizate și testate trei oligos sgRNA din fiecare genă de direcționare. SgRNA cu cea mai bună eficiență knockout determinată de western blotting a fost aleasă pentru experimentele ulterioare. Secvențele sgRNA au fost utilizate pentru celulele umane și de șoarece după cum urmează:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. După incubare timp de 12 ore, 1 ml de supernatant care conține virus cu 8 ng polibren a fost adăugat la celule, urmat de incubare timp de 6 ore. apoi, 0,5 ml mediu regulat suplimentar care conține 10% FBS inactivat termic a fost adăugat și cultivat în continuare peste noapte. Mediul infecțios a fost înlocuit cu 2 ml mediu proaspăt cu 10% FBS și cultivat timp de 72 de ore. celulele au fost trecute la vase de cultură tisulară de 60 mm și selectate prin cultivare în 0,3 hectolitri/ml Puromizină timp de 1 săptămână, iar eliminarea genei vizate a fost verificată prin imunoblotting.

testul Luciferazei

celulele au fost transfectate cu reporteri de luciferază pGL2-basic-CD47 sau pgl2-basic-CD47-XVNF-kB sau pgl2-NF-kB, iar activitatea luciferazei a fost măsurată prin luminometru (Promega, Madison, WI). Pentru normalizarea eficienței transfecției reporter, concentrația totală de proteine a lizaților a fost măsurată cu kitul de testare a proteinelor BCA (Pierce, Rockford, IL) cu BSA ca standard.

testul de Imunoprecipitare a cromatinei (cip)

celulele au fost reticulate cu formaldehidă (1% final) timp de 10 minute, spălate cu PBS rece ca gheața și colectate în tampon de liză SDS (1% SDS, EDTA de 10 mM, Tris de 50 mM, pH 8. 1). Cromatina a fost forfecată prin Sonicare, pre-curățată cu granule de agaroză conjugate cu proteina G și incubată cu anti-P65, anti-c-Rel sau IgG normal la 4 C peste noapte. După ce s-a adăugat proteina G timp de 2 ore la 4 centi C, complexul a fost spălat în mod secvențial cu tampoane de spălare complexe imune cu conținut scăzut și ridicat de sare (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mm Naci pentru sare scăzută și 500 mm NaCI pentru tampoane mari de sare) urmat de tampon TE (de două ori). Interacțiunea ADN – factor de transcripție a fost inversată în urma adăugării de NaCl și incubării la 65 C în timpul nopții. După digestia Rnazei a și proteinazei K, fragmentele de ADN au fost purificate prin extracția fenolului/cloroformului și precipitarea etanolului. ADN-urile au fost purificate și utilizate pentru PCR cu primeri specifici regiunii promotorului de gene care cuprinde situsuri de legare NF-kB. Grundurile CD47 au fost:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Anticorpul monoclonal anti-șoarece CD47 IgG2a (MIAP301) și hybridoma au fost obținute de la Dr.William Frazier (școala de Medicină a Universității Washington). Ambele linii celulare hybridoma au fost menținute în mediu IMDM cu 20% FBS. Anticorpii au fost purificați din supernatantul hybridoma folosind rășină proteică G din GenScript (Catalog # L00209) în urma procedurilor standard de fabricație. Probele au fost apoi concentrate în continuare de 10-20 de ori folosind dispozitive centrifuge Microsep de la Pall Life Sciences. Concentrațiile de IgG purificat au fost determinate prin măsurarea absorbanței la OD280.

testul de fagocitoză

atât celulele THP1 monocitare umane, cât și celulele prime 264,7 m de șoarece (ATCC, TIB-71) au fost menținute într-un incubator de 5% CO2 la 37 CT66 la o densitate aproximativă de 1 ct106 / ml. Aproximativ 0,8 106 celule/ml de 264,5 celule brute sau 1 106 celule THP1 au fost însămânțate pe o placă cu 6 puțuri. După 24 de ore de incubare brută, 264,7 celule au fost activate prin tratarea cu 0,1 hectolitri/ml de lipopolizaharidă (LPS) timp de 24 de ore. celulele THP1 monocite au fost diferențiate prin Phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA) (40 nM) timp de 48 de ore. Macrofagele activate au fost colorate cu Dio la concertarea finală 40 nM într-un mediu timp de 20 min urmată de clătire de trei ori cu mediu. Celulele canceroase au fost etichetate cu 1 xctm DDAO (soluție stoc de 5 mM în DMSO depozitată la -20 xtct) în PBS la 37 xtct timp de 15 min și spălate cu PBS conținând 1% FBS. Celulele țintă marcate cu DDAO (1 0XT 106) au fost adăugate la M XTF colorate cu DIO și incubate într-un volum final de 2 ml la 37 XTF C timp de 2 ore. în urma incubării, m XTF și celulele țintă au fost recoltate cu spălare EDTA-PBS de trei ori, urmată de tripsinizare de 0,25%. Fagocitoza a fost evaluată prin evaluarea celulelor cu dublă etichetă (DIO+/DDAO+), care reprezintă celulele cancerului de sân fagocitat prin M-uri mature, prin citometrie în flux. Software-ul FlowJo a fost utilizat pentru analiză.

testul clonogenic de supraviețuire

testul clonogenic de supraviețuire a fost efectuat în urma radiației cu sau fără tratament (Lapatinib, 10 mmf timp de 72 ore; anticorp anti-CD47 10 MMF / ml peste noapte). Celulele tratate au fost cultivate timp de 10-14 zile și coloniile au fost fixate, colorate cu pată albastră Coomassie. Coloniile care conțin mai mult de 50 de celule au fost numărate ca clone supraviețuitoare și normalizate la eficiența de placare a fiecărei linii celulare tumorale tratate fals.

Gap-filling rate assay

Gap-filling capacity a fost măsurată cu 1 106 de celule crescute în fiecare dintre plăcile cu 6 godeuri până la 100% confluență urmată de 24 de ore de înfometare celulară. Apoi, decalajul a fost creat prin răzuirea vasului în diagonală cu un vârf steril de pipetă. Celulele au fost fie lasate netratate, fie tratate cu 10%/ml de anticorpi IgG sau anti-CD47 pe durata experimentului. Capacitatea de umplere a fost monitorizată timp de 72 de ore și au fost realizate imagini reprezentative în ziua 0 (ziua răzuirii) și Ziua 3.

formarea sferei tumorale

celulele au fost cernute cu 40 de filtre de celule de la o mie de metri (Catalog # 352340. Corning) și suspensiile cu o singură celulă au fost însămânțate în vase Petri cu atașament redus de 60 mm la o densitate de 1000 celule/ml. Celulele au fost crescute în mediu bazal epitelial mamar fără ser (mebm), suplimentat cu B27 (Catalog # 17504-044. Life Technology), 20 ng / ml EGF (Catalog # 4022-500. Bio-viziune), 20 ng / ml basic-FGF (Catalog # 13256-029. Invitrogen), și 4 0XT/ml heparină (Catalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Celulele au fost cultivate timp de 10 zile, iar tumorile au fost numărate sub microscopie luminoasă.

testul invaziei Transwell

alicote (0. 4 ml) de Matrigel (Catalog # 356231. Bd Biosciences) au fost diluate în tampon de acoperire: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl până la concentrația finală de 200-300 octogon/ml. Aproximativ 100 de centicli au fost încărcați în camera superioară a transwell cu 24 de puțuri (Catalog # 3422. Costar) și incubat la 37 centimetric C pentru gelifiere aproximativ 1 h. Îndepărtați cu grijă tamponul de acoperire rămas de pe membrana suport permeabilă, fără a deranja stratul și apoi adăugați celule(2,5 104 / ml). Camera inferioară a fost umplută cu 800 unktl de mediu MEM conținând 5 hectolitri / ml fibronectină (Catalog # SC-29011. Santa Cruz). Transwell-ul cu celule tratate diferit a fost incubat timp de 48 de ore și colorat cu Kit Diff-Quick Stain (Catalog # K7128. IMEB INC).

prepararea F (ab’)2 fragmente

CD47 F (ab’)2 fragmente au fost produse prin scindarea rășinii de papaină a IgG folosind un kit de preparare F (ab’)2 (Catalog # 786272. G-Bioscience) conform recomandărilor producătorului și procedurii raportate67. După digestia papainei, fragmentul Fab a fost separat de IgG nedigerat și regiunea Fc cu coloana de Spin Protein A din kitul de fragmentare Fab coloanele de desalinizare spinout GT-600 au fost furnizate pentru a se asigura că proba inițială de anticorpi este condiția optimă pentru fragmentarea Fab și IgG anti-șoarece CD47 purificat a fost colectat pentru tratamentul tumorii de șoarece in vivo.

radiația celulelor BC cu CRISPR-KO CD47 și/sau HER2

pentru testul in vivo al eficacității inhibării tumorale prin radiații cu deficit de CD47 și HER2, 5 celule 105 4T1/C2 cu CRISPR-knockout de CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) sau dublu (CD47−/−/HER2−/−) au fost implantate în tampoanele de grăsime grup). Creșterea tumorii a fost evaluată prin măsurarea volumului tumorii la fiecare 2 zile începând cu ziua 7 până când volumele tumorale au atins limita. Pentru a evalua radiosensibilitatea tumorilor cu statut diferit de CD47 și HER2, radiația tumorală locală a fost livrată cu 5 Gy fiecărei tumori în ziua 9 și creșterea tumorii a fost măsurată la fiecare două zile până când tumorile de control au atins limitarea maximă.

RT BC de șoarece cu tratament anti-CD47 și/sau HER2

pentru testele in vivo de inhibare a tumorii cu un singur anticorp CD47 în prezența sau absența radioterapiei, tratamentul anti-CD47 a urmat protocolul de Willingham și colab.20 cu unele modificări. Șoarecii femele în vârstă de opt săptămâni (BALB/c), cu competență imună (Charles River Laboratories, Sacramento, SUA), au fost injectați cu 1 celule 4T1 de sân de șoarece 105 în a 4-a glandă mamară. Cincizeci de microlitri PBS care conțin 100 de fragmente de control IgG sau anti-CD47 F (ab’) au fost injectate în locul tumorii (Ziua 1) sau în țesuturile tumorale (ziua 15) și repetate în fiecare zi până la sfârșitul experimentelor. Volumele tumorale au fost monitorizate la fiecare 5 zile. Pentru tratamentul cu radiații, anti-CD47 sau radiații combinate cu anti-CD47, animalele care poartă tumori 4T1 au fost împărțite aleatoriu în diferite grupuri de tratament și un grup de control (5-10 șoareci pe grup). Radiația locală tumorală a început atunci când volumul tumorii atinge 200 mm3 cu FIR (5 Gy/zi/tumoare pentru patru fracții utilizând sursa IR cu micro-fascicul; doza totală = 20 Gy) combinată cu injecții tumorale de trei ori de anti-CD47 F (ab’). Radiosensibilitatea tumorilor iradiate in vivo cu prezența sau absența anti-CD47 F (ab’) a fost evaluată prin măsurarea volumului tumorii la sfârșitul experimentelor. Animalele au fost eutanasiate când tumorile erau de ~1400 mm3 sau când animalele păreau inconfortabile chiar și atunci când tumora era mai mică de 1400 mm3 pentru a se conforma reglementărilor UCD IACUC pentru utilizarea animalelor vertebrate în cercetare. Protocolul de utilizare și îngrijire a animalelor de radioterapie in vivo a fost aprobat de Comitetul instituțional de Utilizare și îngrijire a animalelor de la Universitatea din California Davis (IACUC 15315).

pentru testele in vivo de inhibare a tumorii cu anticorpi dubli la CD47 și HER2 în prezența sau absența radioterapiei, șoarecii de sex feminin cu vârsta de opt săptămâni (balb / c) (Charles River Laboratories, Sacramento, SUA) au fost injectați cu 1 105 celule 4T1 de sân de șoarece în glandele mamare 4. Când volumul tumorii a ajuns la aproximativ 200 mm3, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în patru grupuri (6 șoareci pe grup). Fragmentele de PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) (100 hectogg) sau Herceptin (5 mg/kg) au fost injectate în țesuturile tumorale cu 4 ore înainte de radioterapia locală (5 Gy pe zi timp de 2 zile). Au fost efectuate injecții și dimensiunile tumorii au fost monitorizate în fiecare zi până la sfârșitul experimentelor. Șoarecii au fost eutanasiați când tumorile erau de ~1400 mm3 sau când animalele păreau inconfortabile chiar și atunci când tumora era mai mică de 1400 mm3 pentru a se conforma reglementărilor UCD IACUC pentru utilizarea animalelor vertebrate în cercetare. Protocolul de utilizare și îngrijire a animalelor de radioterapie in vivo a fost aprobat de Comitetul instituțional de Utilizare și îngrijire a animalelor de la Universitatea din California Davis (IACUC 15315).

macrofage infiltrate tumoral și fagocitoză macrofage

celulele 4T1 care exprimă GFP de cancer de sân la șoarece au fost implantate în a 4-a placă de grăsime mamară a șoarecilor BALB / c și tratamentul a fost început atunci când tumorile au obținut aproximativ 200 mm3 prin injectarea tumorală a 50 xqql PBS conținând 100 XQQ de IgG de control, fragmente anti-CD47 F (ab’), Herceptin sau ambii anticorpi o dată la două zile timp de trei ori. Tumor local RT a fost livrat în zilele 10 și 11 cu 5 Gy/zi/tumoră pentru două fracții, doza totală = 10 Gy, iar experimentele s-au încheiat la 2 zile după terminarea tratamentelor cu anticorpi. Tumorile au fost extrase și secțiunile FFPE au fost pregătite pentru colorarea imunofluorescenței pentru a urma procedura standard: diapozitivele au fost deparaffinizate și rehidratate, iar antigenele au fost recuperate timp de 40 min într-un tampon citrat (pH 6,1) la 95 C. pentru a elimina autofluorescența, diapozitivele au fost introduse în soluție de-autofluorescență (0,5 m CuSO4, 0,05 m Nh4cooh în H2O) la RT timp de 48 100 ser de cal. Incubarea primară a anticorpilor s-a făcut la 4 centi C peste noapte: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1: 100; Millipore) ; După spălare, lamele au fost incubate cu 1: 250 anticorpi secundari conjugați fluorescenți diluați (Rodamină pentru CD11b, Alexa Fluor 488 pentru GFP) la RT timp de 1 oră și apoi montate cu soluție Antifade Vectashield conținând DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, ca, SUA). Fagocitoza mediată de macrofage a fost detectată prin microscopie fluorescentă utilizând software-ul Axiovision (Zeiss, Germania), iar microfotografiile au fost cuantificate prin ImageJ.

analiza statistică

toate datele experimentale obținute în urma studiilor celulare in vitro și a testelor pe animale sunt prezentate ca valori medii ale se, analizate utilizând testul T elev cu două cozi pentru două grupuri sau ANOVA pentru mai multe grupuri. Semnificația statistică a curbelor de supraviețuire Kaplan–Meier a fost evaluată cu un test Mann–Whitney. Numărul de experimente independente și replicatele au fost indicate în figura legends. Valorile P< 0,05 au fost considerate semnificative și sunt indicate prin asteriscuri după cum urmează: *P< 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare privind cercetarea naturii legat de acest articol.