celulele T umane exprimă CD25 și Foxp3 la activare și prezintă fenotipuri efectoare/de memorie fără nicio funcție reglatoare/supresoare

activarea celulelor T induce expresia CD25 și Foxp3 asociată cu diferențierea fenotipului efector și de memorie

PBMC au fost stimulate (1 MMC) (B/I) în prezența a 80 U/ml de IL-2 (peprotech) timp de 16 ore. Activarea B / i imită semnalele intracelulare care au ca rezultat activarea celulelor T prin creșterea activității protein kinazei C și, respectiv, a calciului intracelular . Celulele au fost spălate de trei ori și cultivate la 106 celule/mL în mediu complet cu 40 U/mL IL-2 (Peprotech) timp de 3 zile, iar expresia Foxp3 a fost determinată utilizând analiza citometriei în flux. Expresia FoxP3 a fost, de asemenea, determinată pe celule T proaspăt izolate în ziua 0. Așa cum se arată în Fig. 1A( panoul superior), prezența IL-2 în monoterapie timp de 3 zile nu a crescut semnificativ expresia Foxp3 sau CD25 peste nivelurile inițiale în ziua 0 (Fig. 1C). Cu toate acestea, activarea B/I a indus expresia Foxp3 și CD25 în celulele T CD4+ și CD8+ (Fig. 1A, panoul din mijloc). La activarea B / I, celulele T CD4 + CD25 + Foxp3 + au crescut de la 1% la 23% (P = 0,016) și celulele T CD8+CD25+Foxp3+ au crescut de la 0,6% la 9% (P = 0,013). Extinderea culturii în prezența IL-2 timp de 6 zile fără nicio stimulare suplimentară a reținut celulele CD4+CD25+Foxp3+ T peste nivelurile inițiale în celulele T neactivate (1% față de 7%; P = 0,031), în timp ce celulele CD8+CD25+Foxp3+ t au scăzut la nivelurile inițiale (0,6%). Aceste rezultate sugerează că expresia indusă de activare a Foxp3 în celulele T CD4+CD25+ este mai stabilă decât cea din celulele T CD8+CD25+. Numărul absolut de celule T a crescut la 3 și 6 zile după stimularea și expansiunea B/I în prezența IL-2 (Fig. 1B). Activarea celulelor T prin ABS anti-CD3 / CD28 timp de 3 zile a produs rezultate similare ca și pentru activarea B/I prin creșterea celulelor T CD4+CD25+FoxP3+ de la 0,4% la 8,7% (Fig. 1C). Analizele fenotipului celulelor T au evidențiat fenotipuri de memorie CD44+ efector și CD44+CD62L+ înainte și la 6 zile după activarea B/I (Fig. 1D, panoul superior). În timp ce celulele T efectoare CD4+ și CD8+ au fost reduse după activare (18% până la 9% și, respectiv, 21% până la 13%), celulele T de memorie CD4+ și CD8+ au fost crescute (82% până la 91% și, respectiv, 79% până la 87%). La activarea B / I, celulele T CD4 + au prezentat o creștere de 6 ori a expresiei FoxP3 în fenotipurile CD44+, CD62L+ (CD44+: 2,6% până la 15%; CD62L+: 2% până la 12%). În plus, atât celulele T CD4+, cât și CD8+ au prezentat Foxp3expresie ridicată după activare, comparativ cu expresia FoxP3low în ziua 0 (Fig. 1D, panouri de mijloc și de jos). Toate celulele T CD4 + Foxp3 + au exprimat CD44, dintre care 80% au exprimat și CD62L (Fig. 1D, panoul de mijloc, extrema dreaptă). Aceste date arată că 20% din celulele T CD4+Foxp3+ sunt efectoare și 80% sunt fenotipuri de memorie. O tendință fenotipică similară a fost detectată pentru celulele T CD8 + Foxp3+, arătând 100% CD44+ din care 67% au fost celule T CD62L+ (Fig. 1D, panoul de jos, extrema dreaptă). Aceste rezultate arată că 33% din celulele T CD8+Foxp3+ sunt efectoare și 67% sunt fenotipuri de memorie. Datele prezentate în Fig. 1A-D sugerează că expresia crescută a FoxP3high în celulele T efectoare s – a datorat mai degrabă diferențierii celulare decât proliferării celulare, deoarece procentul relativ al celulelor T efectoare CD44+CD62L a scăzut după activarea B/I. Mecanism Similar poate exista în celulele T de memorie din cauza expresiei Foxp3mare după activare, comparativ cu FoxP3low în ziua 0.

expresia FoxP3 indusă de activare în celulele T CD4+ nu transmite funcția de reglare in vitro

celulele T au fost etichetate cu CFSE și stimulate cu Abs anti-CD3 (1 ug/ml) și anti-CD28 (1 ug/ml) în prezența sau absența CD4+CD25 activat+foxp3+ celule T (2:1 și 20:1 răspuns:raporturi supresoare) timp de 3 zile. Analiza citometriei în flux a arătat rate similare de proliferare a celulelor T CD8+ închise în absența sau prezența celulelor T foxp3+ inductibile (Fig. 2A, 60% vs. 61% și 65%). Activarea CD3 / CD28 a indus, de asemenea, expresia FoxP3 în celulele T CD4+ respondente. Celulele T închise CD4 + FpxP3 + au prezentat, de asemenea, proliferare de 70-75% la activare (Fig. 2A). Analiza apoptozei celulelor T a evidențiat rate similare de apoptoză în celulele T respondente în absența sau prezența celulelor T CD4+FoxP3+ (Fig. 2B, 57% față de 57 și 59%). Majoritatea celulelor T CD4+FoxP3+ activate B/I (74-76%) s-au dovedit a fi apoptotice în timpul activării anti-CD3/CD28 în co-cultură cu celule T respondente.

activarea alogenă a celulelor T în timpul MLR induce expresia Foxp3 în celulele T CD4+CD25+ asociate cu fenotipul efector/memorie

am efectuat un MLR alogenic de 8 zile pentru a determina dacă inducerea expresiei Foxp3 în celulele T a fost stabilă în timpul MLR proliferarea celulelor T. Celulele respondente și stimulatoare au fost obținute de la diferiți donatori sănătoși. Celulele stimulatoare au fost iradiate (5000 rad) și cultivate cu celule respondente timp de 8 zile în prezența a 10 mm brdu (bd Pharmingen). Celulele au fost apoi colorate cu Abs relevante și supuse analizei citometriei în flux. Așa cum se arată în Fig. 3A (panoul superior) 86% din celulele T CD4+CD25+ și 93% din celulele T CD8+CD25+ au prezentat încorporarea BrdU ca urmare a proliferării celulare. Nu a fost detectată nicio proliferare numai în celulele respondente sau stimulatoare (datele nu sunt prezentate). O astfel de proliferare alogenă a avut loc în prezența unei expresii Foxp3 induse de activare în celulele T CD4+, astfel încât 8% din celulele T CD4+ au fost CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, panoul de jos). CD8 + CD25 + celulele T, pe de altă parte, nu au prezentat o expresie stabilă a Foxp3. Aceste rezultate sunt în concordanță cu observația noastră din Fig. 1 arătând că expresia Foxp3 în celulele T CD4 + este mai stabilă decât cea din celulele T CD8+ la 6-8 zile după activarea celulelor T. În rapoartele anterioare, testele supresive in vitro au fost efectuate în prezența unor rapoarte ridicate de celule T CD4+CD25+ (Tregs) la celulele respondente, pentru a determina funcția supresivă asupra activării și proliferării celulelor T. Astfel de creșteri artificiale ale raportului dintre celulele T CD4+CD25+ și celulele respondente ar reduce validitatea in vivo a observației. Frecvența celulelor T CD4 + CD25 + Foxp3 + indusă în timpul MLR a fost de 8%, ceea ce se consideră a se încadra în intervalul relevant fiziologic, raportat de alte grupuri . Frecvența Treg-urilor care apar în mod natural la șoarece este, de asemenea, în jurul acestui interval, având totuși efecte de reglementare pentru inhibarea autoimunității. Dacă Foxp3 care exprimă celulele T CD4 + a avut orice funcție de reglare, ar fi trebuit să inhibe proliferarea celulelor în timpul culturii in vitro. Similar activării celulelor T induse de B / I, fenotipurile celulelor T dintr-un MLR au inclus CD44+ efector (16%) și CD44+CD62L+ celule T de memorie (84%) (Fig. 3B). Din nou, toate celulele CD4+Foxp3+ t au exprimat CD44, dintre care 90% au exprimat și CD62L (Fig. 2B). Aceste date arată că 10% din celulele T CD4+Foxp3+ sunt efectoare și 90% sunt fenotipuri de memorie. O tendință fenotipică similară a fost detectată pentru celulele T CD8+Foxp3+, arătând 100% CD44+ din care 76% au fost celule T CD62L+. Aceste rezultate arată că 24% din celulele T CD8+Foxp3+ sunt efectoare și 76% sunt fenotipuri de memorie. Lipsa funcției de reglare în aceste celule T Foxp3 + se poate datora fenotipului efector/memorie, deoarece s-a raportat că expresia Foxp3 în celulele T ale memoriei umane a dus la diminuarea activității supresoare . În plus, celulele Treg de tip 1 (Tr1) conferă funcția supresoare în absența expresiei FoxP3 . Având în vedere rolul Foxp3 ca regulator principal al angajamentului și întreținerii liniei Treg la șoarece , nu pare să aibă o astfel de funcție de reglementare bona fide pentru angajamentul liniei Treg în celulele T umane.