Encephalitozoon cuniculi tulpina III este o cauză a Encefalitozoonozei atât la oameni, cât și la câini

rezumat

Microsporidiile sunt organisme eucariote intracelulare obligatorii găsite într-o gamă largă de gazde vertebrate și nevertebrate. Encephalitozoon cuniculi se găsește frecvent la iepurii domestici și rozătoare și apare și la câini, alte canide și primate, inclusiv la oameni. Secvențierea ADN a genelor ARN ribozomale a fost utilizată pentru a identifica acești paraziți la nivel de specie și pentru a defini tulpinile E. cuniculi I, II și III. opt noi izolate de câine au fost caracterizate ca tulpina E. cuniculi III prin utilizarea metodelor moleculare. Această tulpină a fost, de asemenea, identificată în izolate de la oameni imunocompromiși, sugerând potențialul zoonotic al acestei specii de paraziți. De asemenea, este raportată vărsarea prelungită de spori microsporidiali de la câinii asimptomatici.

Encephalitozoon cuniculi este un protozoar intracelular obligatoriu al filumului Microspora și este un parazit comun al iepurilor și rozătoarelor domestice. Ocazional, acești paraziți au fost raportați la alte gazde, inclusiv câini, vulpi albastre (Alopex lagopus) și un număr mic de alte carnivore sălbatice . Un număr tot mai mare de rapoarte descriu, de asemenea, boala clinică la om cauzată de E. cuniculi, dar sursa(sursele) infecției umane este necunoscută .

Din punct de vedere istoric, identitatea parazitului s-a bazat pe caracteristici morfologice și uneori ultrastructurale. Recent, membrii morfologic similari ai genului Encephalitozoon au fost specializați prin utilizarea caracteristicilor imunologice și a caracterizării moleculare a genelor ARN ribozomale . Izolatele de E. cuniculi au fost împărțite în continuare ca tulpini I, II sau III, pe baza numărului de repetări ale unei secvențe de 4 baze (5′-GTTT-3′) în regiunea distanțierului transcris intern (ITS) a genei ARN ribozomal . Două izolate de câine E. cuniculi au fost desemnate tulpina III pe baza prezenței a 4 repetări de secvență . Ulterior, în două rapoarte din Europa au fost identificate ca tulpini umane de tip „Donovan” GenBank X98466, CDC:V282 și IPZ:MX-H5, precum și ca tulpini umane de tip ” I „(tulpini de tip „Donovan” GenBank X98466, CDC: V282 și IPZ: MX-H5). Acest studiu extinde această activitate prin identificarea a 8 izolate suplimentare de câini de E. cuniculi din 4 focare ca tulpina III. deși nu există date epidemiologice care să confirme direct transmiterea de la câine la om, datele moleculare sugerează că câinii pot servi drept rezervoare potențiale de paraziți. În plus, a fost documentată vărsarea pe termen lung a sporilor de către câinii asimptomatici, consolidând în continuare probabilitatea transmiterii zoonotice a parazitului.

materiale și metode

izolate parazitare

corpurile a 7 pui de la 3 pui fără legătură și 1 câine au fost trimise pe parcursul a 18 luni la laboratorul de Diagnostic Veterinar Texas pentru evaluare postmortem. Animalele provin din patru surse independente din diferite regiuni ale Texasului. Un diagnostic de encefalitozoonoză a fost făcut în fiecare caz pe baza constatărilor histologice. Opt izolate parazitare au fost stabilite din țesuturile proaspete ale animalelor: 5 izolate au fost derivate din țesuturile creierului sau rinichilor de 5 până la 7 săptămâni Boston terrier catelus littermates (2 masculi, 3 femele) care au murit de boli neurologice (izolate 1-5, gunoi 1). Izolatul 6 a fost derivat din creierul unui mascul Maltez Terrier în vârstă de 10 săptămâni, care a fost 1 din 4 littermates (litter 2) care a murit de boli neurologice. Izolatul 7 a fost derivat din creierul unui catelus de pudel in miniatura de 10 saptamani (litter 3) care a murit de boala neurologica. Izolatul 8 a fost derivat din rinichiul unui dachshund miniatural feminin de 18 luni care a murit de insuficiență renală (tabelul 1).

la postmortem, țesuturile au fost colectate aseptic și omogenizate (ten Broeck tissue omogenizer; Corning, Corning, NY) folosind PBS, pH 7.2, plus 2 soluție antibiotico-antimicotică (Gibco, Gaithersburg, MD). Sporii microsporidiali au fost purificați din omogenatul țesutului gazdă folosind o metodă de gradient de densitate Percoll descrisă anterior modificată prin schimbarea vitezei de centrifugare la 600 g . Microsporidiile au fost cultivate în celule RK-13 (ATCC CCL-37) utilizând mediul RPMI 1640 suplimentat cu 5% ser fetal bovin și 2 soluție antibiotico-antimicotică (Gibco), așa cum s-a descris anterior . Cultura parazitară și analiza ADN au fost efectuate pe parcursul mai multor luni pe baza primirii diferitelor probe de caz, astfel încât posibilitatea contaminării încrucișate accidentale a fost neglijabilă.

izolarea ADN

pentru izolatele 1-6 și 8, paraziții au fost crescuți în culturi pe termen scurt pentru a genera spori adecvați pentru caracterizarea moleculară. Pentru izolatul 7, paraziții au fost purificați direct din țesutul cerebral proaspăt al cățelușului pentru izolarea ADN-ului. Pentru majoritatea izolatelor, ADN-ul a fost extras din sporii purificați folosind matricea Instagene (BioRad, Hercules, CA), urmând protocolul producătorului pentru culturile bacteriene . Pentru unele dintre lucrările moleculare cu izolatele 6 și 8, sporii au fost prelucrați așa cum s-a descris anterior , iar ADN-ul a fost extras din spori printr-o metodă standard de extracție a fenolcloroformului folosind un sistem de tuburi microfuge cu gel de partiționare (sistem de blocare a gelului cu fază ușoară; 5 Prime 3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) pentru a optimiza recuperarea ADN-ului. ADN-ul a fost precipitat cu etanol, peleta a fost omogenizată în TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, pH 7,6), iar concentrația ADN-ului a fost estimată utilizând rapoarte A260 : A280 prin spectrofotometrie UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). ADN—ul extras din sporii de encefalitozoon hellem derivați din culturi tisulare a fost utilizat ca martor pozitiv, iar un control negativ numai cu reactiv a fost inclus în toate reacțiile de extracție și secvențiere.

secvențierea și analiza parțială a ADN-ului ribozomal al subunității mici (ARNr SSU)

o porțiune a capătului 5′ al genei ARNr SSU din fiecare dintre cele 8 izolate a fost amplificată prin utilizarea perechii de primeri PMP1 și PMP2, așa cum s-a descris anterior . Reacția de reacție în lanț a polimerazei (PCR) pentru fiecare izolat a fost efectuată urmând instrucțiunile producătorului (reactivi geneamp PCR core, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Amplificarea s-a făcut într-un cicler termic (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). După denaturarea inițială timp de 5 min la 95 centimetric C, la fiecare reacție de 25-centimetric s-a adăugat polimerază Taq (0,5 U). Probele au fost apoi supuse la 35 de cicluri de denaturare (94 ct, 30 s), recoacere (60 ct, 30 s) și extensie (72 ct, 1 min) urmate de 10 min la 72 CT, pentru extensie finală. Nucleotidele necorporate au fost îndepărtate folosind coloane de cromatografie (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Probele au fost ținute la 4 centimetrii C până la prelucrare pentru secvențiere automată.

analiza ADN a regiunii ITS

o porțiune din regiunea ITS a genei ARN ribozomale a fiecărui izolat a fost amplificată prin PCR cu perechea de primeri int530f și int580r , utilizând metodele de amplificare descrise mai sus. Produsul PCR rezultat a fost secvențiat într-un secvențiator automat de ADN (model 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

secvențierea automată a ADN-ului

ADN-ul amplificat PCR al fiecărui izolat a fost amplificat pentru secvența automată cu un kit comercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) urmând instrucțiunile producătorului. Toate reacțiile au fost efectuate într-un termocicler (Minicicler de cercetare MJ). Probele au fost apoi supuse la 35 de cicluri de denaturare (94 ct, 30 s), recoacere (60 ct, 30 s) și extensie (72 ct, 1 min) urmate de 10 min la 72 CT, pentru extensie finală. Produsele de extensie au fost purificate cu ajutorul coloanelor de cromatografie (Micro Bio-Spin; BioRad), uscate într-o centrifugă de vid (Savant Instruments, Holbrook, NY) și depozitate la -20 centi C până la secvențierea într-un secvențiator automat (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

prin utilizarea software-ului de aliniere (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI), s-au obținut secvențe de consens ale bazelor 265 de la suta pentru o porțiune a genei ARNr SSU pentru fiecare izolat de parazit. Aceste secvențe au fost evaluate pentru omologie împotriva secvențelor Encefalitozoon raportate anterior în baza de date NCBI GenBank folosind o simplă căutare BLASTN.

ADN dublu catenar heteroduplex test de mobilitate

ADN-ul din izolatul 6 a fost amplificat prin PCR cu perechea de primeri int530f și int580r așa cum s-a descris anterior . Produsele amplificate PCR au fost testate pentru generarea heteroduplexelor și homoduplexelor folosind izolate caracterizate anterior de E. cuniculi de la diferite gazde.

rezultate

Un total de 8 izolate parazitare din 4 focare clinice separate au fost stabilite în culturi tisulare. Atât caracteristicile microscopice ușoare, cât și caracteristicile de creștere in vitro ale paraziților au sugerat că sunt E. cuniculi, un microsporidian raportat anterior la câini, precum și la alte gazde. Secvențierea parțială a capătului 5′ al genei SSU rRNA a fiecărui izolat (GenBank AF144246–AF144253) a confirmat identitatea paraziților ca E. cuniculi, deoarece toate exemplarele au prezentat omologie 100% cu secvențe publicate anterior (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

analiza Heteroduplex și secvențierea regiunii sale a genei ARN ribozomal au caracterizat în continuare toate izolatele de câine ca tulpina III, confirmând rapoartele anterioare ale variațiilor subtile dintre izolatele E. cuniculi de la diverse gazde rozătoare, iepure și umane. Figura 1 ilustrează formarea homoduplexului ADN între izolatul canin 6 și un izolat de tulpina III caracterizat anterior, precum și formarea heteroduplexului între izolatul 6 și celelalte tulpini de E. cuniculi.

discuție

semnificația biologică a mai multor tulpini de E. cuniculi nu a fost încă clarificată; cu toate acestea, capacitatea de a distinge între tulpinile parazitare poate oferi un instrument pentru urmărirea surselor de infecție în studiile epidemiologice. Datele noastre moleculare care identifică 8 izolate microsporidiene de la câini ca tulpina E. cuniculi III sunt în concordanță cu un studiu anterior care a clasificat 2 izolate de câine ca tulpina III . Tulpinile de iepure, șoarece și vulpe au fost raportate ca tulpini I sau II . Aceste date sugerează că tulpina III ar putea fi asociată predominant cu câinii. Izolatele umane au fost identificate ca tulpina III în emisfera vestică și ca tulpina I în Europa . Deși sursa(sursele) expunerii umane la E. cuniculi este necunoscut, există dovezi din ce în ce mai mari că animalele pot servi drept rezervoare de infecție și există posibilitatea transmiterii zoonotice a organismului între animale și oameni. Este o posibilitate interesantă ca diferențele geografice și culturale în proprietatea animalelor de companie să joace un rol în expunerea umană, deoarece câinii sunt animale de companie comune în Statele Unite, în timp ce iepurii sunt ținuți frecvent ca animale de companie sau ca hrană în Elveția și în alte țări europene.

examinarea probelor de fecale și urină de la părinții Boston terrier normali din punct de vedere clinic și 1 pui din așternut 1 au arătat niveluri scăzute de vărsare a sporilor timp de 4 luni după decesele colegilor de gunoi (izolatele 1-5; date nepublicate). Această observație sugerează în continuare un posibil mecanism de transmitere directă sau indirectă a paraziților de la câini la oameni prin contaminarea mediilor localizate cu excreții urinare și fecale ale câinilor. Deși niciun studiu epidemiologic nu a evaluat relația dintre proprietatea/expunerea animalelor de companie și infecțiile microsporidiale umane, într-un singur caz în care copiii au fost expuși la cățeluși cu encefalitozoonoză evidentă, 1 din 3 copii seroconvertiți . Izolatele E. cuniculi suplimentare de la diferite gazde trebuie analizate pentru a evalua în continuare riscul menținerii animalelor de companie potențial infectate în gospodăriile persoanelor imunocompromise cu risc ridicat de infecții microsporidiale.

mulțumiri

mulțumim patologilor Laboratorului de Diagnostic Medical Veterinar din Texas Jay Hoffman, Joanne Mansell și Bruce Abbitt pentru furnizarea de țesuturi canine pentru acest studiu.