etichetarea fluorescentă

definiție

etichetarea fluorescentă este procesul de legare a coloranților fluorescenți la grupurile funcționale conținute în biomolecule, astfel încât acestea să poată fi vizualizate prin imagistica fluorescentă (nature.com). disponibilitatea noilor fluorofori a schimbat dramatic posibilitățile de detectare sensibilă a biomoleculelor și analiza interacțiunilor acestora. Coloranții fluorescenți îmbunătățiți permit acum studii imposibile anterior ale structurilor celulare și proceselor celulare. Etichetele fluorescente oferă multe avantaje, deoarece sunt foarte sensibile chiar și la concentrații scăzute, sunt stabile pe perioade lungi de timp și nu interferează cu funcția moleculelor țintă. Imagistica țintită a celulelor etichetate permite urmărirea lor in vitro și in vivo. Utilizarea fluoroforilor diferiți în aceeași probă poate permite, de asemenea, observarea simultană a mai multor molecule în același timp. Cele mai frecvent utilizate fluorofori sunt izotiocianatul de fluoresceină (FITC), derivații de rodamină (TRITC), cumarina și cianina. Acești coloranți organici sintetici sunt utilizați pentru a eticheta biomoleculele ca proteine, peptide, anticorpi, acizi nucleici, bacterii sau drojdie. Fluorochromii naturali, cum ar fi proteina fluorescentă verde (GFP), pot fi, de asemenea, utilizați pentru a eticheta genetic celulele vii.etichetarea fluorescentă a proteinelor permite cercetătorilor să investigheze dinamica conformațională și interacțiunile moleculare ale proteinelor sau să urmărească mișcările acestora pentru a înțelege mai bine funcțiile lor biologice (Modesti M, 2011). Pentru a obține o perspectivă mai bună asupra structurilor proteice și a activității enzimatice care leagă receptorul-ligand, peptidele unice pot fi, de asemenea, etichetate. Anticorpii marcați cu fluorocrom sunt utilizați pe scară largă în cercetarea biomedicală pentru a detecta antigeni în testele de imunofluorescență și sunt, de asemenea, instrumente esențiale în imunodiagnostică. Pentru a asigura rezultate fiabile, conjugarea fluoroforului nu trebuie să interfereze cu caracteristicile de legare a antigenului anticorpului (Nath N și colab., 2016).

etichetarea fluorescentă a acizilor nucleici
testele pe bază de fluorescență joacă un rol major în studiile biofizice ale structurii, funcției și dinamicii acizilor nucleici. Progresele recente în metodele de etichetare și sistemele de imagistică au permis observarea directă in vivo a ADN-ului și ARN-ului și a interacțiunilor acestora cu alte componente celulare. Imagistica cu celule vii a acizilor nucleici a deschis noi căi pentru o mai bună înțelegere a organizării cromatinei și a reglării expresiei genelor. (Dirks RW și colab., 2018).

etichetarea fluorescentă a polizaharidelor
polizaharidele complexe, cum ar fi heparina, sunt componente structurale ale matricei extracelulare. Aceste polizaharide sunt esențiale pentru aderența, migrația și creșterea celulară (Prigent-Richard S. și colab., 1998). Unii compuși sunt, de asemenea, cunoscuți pentru proprietățile lor anticoagulante, antitrombotice, antiinflamatorii, antivirale și antiangiogene. Metodele bazate pe fluorescență facilitează identificarea noilor polizaharide bioactive și caracterizarea funcțiilor lor biologice (Roger O și colab., 2002).

etichetarea fluorescentă a lipidelor
lipidele celulare joacă un rol crucial în celulă pentru stocarea energiei, pentru formarea membranelor celulare și pentru procesele de semnalizare intracelulară (Maekawa M. și Fairn G, 2014). Colorantul lipofil Nile red este utilizat pe scară largă pentru a colora lipidele intracelulare pentru a analiza locația și organizarea acestora (Greenspan P și colab., 1985). Mai mult, pentru studierea dinamicii lipidelor, este posibilă și etichetarea specifică în celulele vii (Schultz C și colab., 2010).

tehnici de etichetare fluorescentă

metodele de etichetare fluorescentă utilizate în mod obișnuit utilizează tehnici chimice, enzimatice, peptide/proteine și etichetare genetică (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).

• tehnici de etichetare chimică: Fluoroforii se fixează la moleculele țintă prin modificări chimice (legare covalentă sau necovalentă). Metodele de etichetare chimică au mai multe avantaje, deoarece sunt robuste, ușor de realizat și foarte eficiente cu o gamă largă de fluorofori. Sunt mai potrivite pentru studii in vitro decât in vivo.
• tehnici de etichetare enzimatică: reacțiile enzimatice permit etichetarea rapidă, extrem de eficientă și selectivă in vivo și in vitro și pot fi utilizate pentru a viza proteine sau celule întregi. Cu toate acestea, datorită dimensiunii mari a etichetelor, pot apărea interferențe cu funcția moleculelor țintă.
• peptidă / etichetă proteică: o tehnică recent dezvoltată și foarte promițătoare permite etichetarea specifică și selectivă a proteinelor prin încorporarea unor etichete fluorescente scurte care nu perturbă plierea sau funcția moleculei. Această tehnică este, de asemenea, ușor de realizat și poate fi utilizată pentru a investiga diferite site-uri ale proteinelor unice, în funcție de specificitatea etichetei peptidice.
• etichetare genetică: etichetarea genetică poate fi realizată folosind domenii proteice, peptide mici sau aminoacizi unici care sunt marcați cu coloranți fluorescenți și se pot atașa în mod specific la site-uri de-a lungul cromozomilor in vivo. Această abordare permite detectarea anomaliilor cromozomiale, cum ar fi ștergerile sau duplicarea.
• etichetare Multicolor: O cerință comună pentru imagistica cu celule vii și pentru aplicațiile de citometrie în flux este capacitatea de a urmări sau detecta mai multe proteine etichetate fluorescent în același timp. În acest scop, pot fi utilizate coloranți special concepuți cu o schimbare Stokes foarte mare, care permit monitorizarea simultană a diferitelor procese biochimice.

teste pe bază de fluorescență

testele pe bază de fluorescență se bazează pe capacitatea fluoroforilor de a emite din nou lumină după expunerea la particule de lumină sau fotoni. Diferența de lungime de undă între lumina de excitație și lumina de emisie, așa-numita schimbare Stokes, poate fi detectată în microscoape și sisteme de imagistică. Fiecare fluorofor are o schimbare specifică Stokes. Diferite teste permit cercetătorilor să localizeze biomoleculele, să le observe în timp real, să investigheze interacțiunile lor și să studieze activitățile enzimatice.

• microscopia fluorescentă
  microscopia fluorescentă permite identificarea celulelor și a componentelor celulare și monitorizarea fiziologiei celulare cu specificitate ridicată. Microscopia fluorescentă separă lumina emisă de lumina de excitație folosind filtre optice. Utilizarea a doi indicatori permite, de asemenea, observarea simultană a diferitelor biomolecule în același timp. În timp ce sistemele convenționale de imagistică permit o rezoluție de 200 până la 300 nm datorită limitelor fizice de difracție, noile Microscoape de fluorescență cu super-rezoluție ca sted (epuizarea emisiilor stimulate) depășesc aceste limite și oferă informații despre lumea nanometrică a moleculelor (Sanderson MJ et al, 2014).
• citometria în flux
  citometria în flux este utilizată pe scară largă în cercetarea de bază și în practica clinică pentru a măsura semnalul de la fluorofori specifici. Celulele și particulele sunt analizate și în cele din urmă sortate în „timp real” pe măsură ce trec prin fasciculul de lumină al detectoarelor care cuantifică fluorescența produsă de anticorpi sau liganzi marcați. Acești markeri se leagă de molecule specifice de pe suprafața celulei sau din interiorul celulei, permițând detectarea și cuantificarea acestora. Mai mulți parametri ca mărime și volum pot fi măsurați pe celule unice, iar diferite tipuri de celule pot fi izolate și caracterizate (Nolan JT și Condello D, 2013). Citometria în flux găsește aplicații largi în domenii precum imunologia, hematologia, medicina transplantului, oncologia și genetica.
• fluorescenta hibridizare in situ(FISH)
  fluorescenta hibridizare in situ (FISH) permite localizarea secvențelor ADN specifice pe cromozomi. Probele fluorescente de ADN sau ARN sunt utilizate pentru hibridizarea și identificarea secvențelor ADN țintă complementare. Peștele a fost folosit în mod tradițional pentru a cartografia genele pe cromozomi, de exemplu, în timpul proiectului genomului uman. Astăzi hibridizarea fluorescentă in situ este utilizată în principal în scopuri de diagnostic în detectarea anomaliilor cromozomiale sau în analiza celulelor canceroase (O ‘ Connor C, 2008).
• spectroscopia de corelație a fluorescenței (FCS)
  spectroscopia de corelație a fluorescenței (FCS) permite analiza modificărilor temporale ale intensității fluorescenței fluorochromilor, care sunt cauzate de influențe chimice, biologice sau fizice. FCS a fost introdus pentru prima dată pentru a investiga interacțiunea dintre medicamente și ADN și reprezintă acum un instrument sensibil pentru determinarea nivelurilor de concentrație și agregare a proteinelor, precum și pentru observarea interacțiunilor moleculare (Tian Y și colab., 2011).
• Microarrays
  Microarrays permite studiul expresiei genelor în condiții diferite. Mii de gene pot fi examinate în același timp pe cipuri ADN. Acestea sunt diapozitive microscopice imprimate cu pete minuscule care conțin secvențe de ADN cunoscute care se pot lega selectiv de moleculele de ARNm/ADNc marcate fluorescent. După hibridizare, cipul ADN este citit, iar datele sunt utilizate pentru a crea profiluri de expresie genetică (Hoen PAC și colab., 2003).

etichetă fluorescentă: imagistica cu celule vii

observarea cinetică a proceselor celulare folosind microscopia fluorescentă time-lapse a devenit o tehnică fundamentală în biologia celulară, deoarece imagistica cu celule vii poate oferi informații foarte valoroase despre creșterea celulară și mecanismele de transport. O provocare majoră în microscopia time-lapse este minimizarea efectelor fototoxice rezultate din fotobleaching. Expunerea la lumină distruge progresiv moleculele fluorescente, ducând la o reducere a semnalului de fluorescență și la formarea de radicali liberi care pot deteriora celulele. Prin urmare, este crucial ca metoda de imagistică cu celule vii să găsească un echilibru între reducerea expunerii la lumină cât mai mult posibil și obținerea de semnale utile pentru observarea celulelor. Oamenii de știință trebuie, de asemenea, să creeze un mediu fiziologic care să permită replicarea îndeaproape a dinamicii in vivo. (Ettinger și Wittmann T, 2014).

etichetarea fluorescentă PromoCell

disponibilitatea noilor fluorofori a schimbat dramatic posibilitățile de detectare sensibilă a biomoleculelor și analiza interacțiunilor acestora. Coloranții fluorescenți îmbunătățiți permit acum studii imposibile anterior ale structurilor celulare și proceselor celulare. PromoCell oferă o gamă largă de fluorofori de înaltă calitate pentru etichetarea fluorescentă a diverselor biomolecule: etichetarea proteinelor, etichetarea anticorpilor, etichetarea acidului nucleic (etichetarea ADN, etichetarea ARN), precum și kituri complete de etichetare și conjugate fluorescente gata de utilizare.

coloranții noștri Promofluori sunt alternative rentabile la fluoroforii cunoscuți, care conduc și acoperă spectrul de lungimi de undă de la albastru la roșu îndepărtat. Acestea prezintă o intensitate remarcabilă a fluorescenței și fotostabilitate, o absorbție puternică a luminii, un randament cuantic ridicat al fluorescenței și o solubilitate bună în apă și pot fi utilizate pentru microscopia fluorescentă, hibridizarea fluorescentă in situ (FISH), spectroscopia de corelație a fluorescenței (FCS) și microarrays (proteine, ADN). Unele dintre ele oferă o schimbare Stokes foarte mare, ceea ce le face ideale pentru etichetarea multicoloră sau aplicații de citometrie în flux. Coloranții PromoFluor sunt disponibili, de ex. ca esteri NHS, maleimide și etichete amino-modificate gata pentru cuplare covalentă sau ca conjugate cu biotină, faloidină și deoxinucleotide (dUTPs). Mai mult decât atât, oferim, de asemenea, proteine de înaltă calitate & kituri de etichetare a anticorpilor cu diferite coloranți PromoFluor.