frontiere în farmacologie

Introducere

proteinele membranare participă la evenimente fiziologice fundamentale în fiecare sistem biologic de la bacterii la oameni. >50% din medicamentele comercializate vizează proteinele membranare, în timp ce direcționarea farmacologică a multor alte proteine membranare este considerată potențial benefică în numeroase aplicații biomedicale (Overington și colab., 2006; y Oktld Oktld Oktld și colab., 2007; Arinaminpathy și colab., 2009). Cu toate acestea, mecanismele moleculare care stau la baza funcției și reglării lor rămân în mare parte necunoscute din cauza lipsei de informații structurale. Într-adevăr, în timp ce proteinele membranare reprezintă ~26% din proteomul uman, structurile lor reprezintă doar 2% din structurile din Banca de date a proteinelor (Fagerberg și colab., 2010; Pandey și colab., 2016). Mai multe obstacole împiedică investigarea structurală a proteinelor membranare, necesitând dezvoltarea tehnologiilor de ultimă generație pentru elucidarea arhitecturilor lor moleculare (Pandey și colab., 2016; Masson și colab., 2017; Hagn și colab., 2018; Ravula și Ramamoorthy, 2019; Redhair și colab., 2019). Obstacolele majore sunt că supraexprimarea și purificarea lor și studiile structurale prin majoritatea tehnicilor (de exemplu, cristalografia cu raze X) rămân limitate în multe cazuri. În consecință, aceste obstacole împiedică dezvoltarea rațională a candidaților la medicamente care vizează proteinele membranare legate de boală (Vinothkumar și Henderson, 2010; Lounnas și colab., 2013; Marciano și colab., 2014).

transportorii secundari sunt proteine legate de membrană care catalizează selectiv mișcarea substanțelor dizolvate slab permeabile (de ex. neurotransmițători, medicamente) pe membrana celulară, susținând diverse funcții celulare în sănătate și boli. Transportorii secundari respectă paradigma de acces alternativ, conform căreia buzunarul de legare a ligandului proteic devine alternativ accesibil pe părțile opuse ale membranei prin adoptarea succesivă a stărilor orientate spre interior (IF) și orientate spre exterior (OF) (Jardetzky, 1966; Forrest și colab., 2011). Descoperirile recente în biologia structurală a proteinelor membranare au oferit o multitudine de structuri de transportori legați de membrană în diferite stări conformaționale (Drew și Boudker, 2016; Bai și colab., 2017), oferind informații despre mecanismele lor de transport și recunoaștere a substanțelor dizolvate. Cu toate acestea, ele oferă instantanee statice ale unui proces inerent în mai multe etape (Seeger, 2018). Astfel, există o nevoie tot mai mare de a dezvolta noi abordări pentru a investiga dinamica proteinelor membranare (Konermann și colab., 2011; Smith și colab., 2012; Sim și colab., 2017; Mandala și colab., 2018; Burke, 2019). Acestea includ o combinație de simulări de dinamică moleculară (MD) (Roux și colab., 2011; Zdravkovic și colab., 2012; Zhekova și colab., 2016; Zhekova și colab., 2017; Harpole și Delemotte, 2018) cu tehnici experimentale avansate, inclusiv tehnici spectroscopice și microscopie electronică criogenică cu o singură particulă (Smith și colab., 2012; Pandey și colab., 2016; Castell și colab., 2018; Hagn și colab., 2018; Ravula și Ramamoorthy, 2019; soare și Gennis, 2019).spectrometria de masă cu schimb de hidrogen-deuteriu (HDX-MS) a câștigat atenție în ultimii ani pentru studierea dinamicii proteinelor membranare, chiar dacă a fost folosită de zeci de ani pentru a caracteriza proteinele solubile (Konermann și colab., 2011; Vadas și colab., 2017). HDX-MS monitorizează schimbul dependent de timp al solventului D2O cu hidrogeni de amidă de coloană vertebrală în condiții native. Cursul de schimb al deuteriului depinde de accesibilitatea solventului, structura secundară și rigiditatea structurală (Konermann și colab., 2011). Cuplat cu digestia proteolitică și separarea peptidelor, HDX-MS permite cuantificarea cursurilor de schimb în segmente scurte de proteine, până la rezoluția cu un singur reziduu. Două avantaje majore ale HDX-MS sunt că sunt necesare cantități mici de proteine (< 0,1 mg) pentru analiză și că etichetarea chimică a proteinelor nu este necesară, evitând perturbațiile structurale nedorite. Aici, rezumăm progresele și aplicațiile recente în utilizarea HDX-MS pentru studierea dinamicii structurale a transportatorilor.

principiile spectrometriei de masă de schimb hidrogen-deuteriu

principiile HDX-MS sunt descrise pe scurt și calitativ mai jos, pentru a permite o discuție a aplicațiilor sale pentru studierea transportatorilor. Pentru explicații aprofundate, sunt disponibile mai multe articole de revizuire excelente (Konermann și colab., 2011; Rand și colab., 2014; Engen și țara Galilor, 2015; Masson și colab., 2017; Oganesyan și colab., 2018; Masson și colab., 2019; Redhair și colab., 2019).

în experimentele HDX, deuteriul se schimbă cu hidrogeni proteici labili într-o manieră dependentă de timp, după diluarea proteinelor într-un tampon D2O (Masson și colab., 2017) (Figura 1). HDX-MS monitorizează în principal schimbul de hidrogeni amidă de coloană vertebrală, deoarece i) la pH neutru sunt schimbate în rate care pot fi detectate folosind HDX-MS (secunde până la zile) și ii) schimbul lor poate fi stins în mod eficient (Marcsisin și Engen, 2010; Gallagher și Hudgens, 2016). Rata HDX depinde de mai mulți parametri. Hidrogenii amidici pot prezenta o „stare închisă”, care rezultă din participarea la legături stabile de hidrogen în structurile secundare sau din inaccesibilitatea solventului, care nu permite schimbul lor cu deuteriu solvent sau o” stare deschisă ” în care poate apărea abstractizarea protonilor, etapa de limitare a vitezei HDX (Oganesyan și colab., 2018). În plus, reacția are o constantă intrinsecă a vitezei chimice, care depinde de pH, temperatură și mediul reziduurilor (Oganesyan și colab., 2018).

tranziția dintre stările închise și cele deschise are loc prin evenimente locale care se desfășoară. În condiții native, în care proteinele sunt bine pliate, rata HDX depinde în principal de rata de tranziție înapoi la starea închisă (Weis și colab., 2006). Dacă Regiunea proteică desfășurată revine la starea închisă la o rată mult mai lentă decât cursul de schimb chimic, se observă cinetica EX1, rezultând o absorbție corelată a deuteriului în reziduurile vecine. Aceasta are ca rezultat două populații: una cu M/z scăzut și una cu M/z ridicat, reflectând peptide din molecule de proteine care nu au și care au suferit schimb, respectiv. Cu timpul, populația m/z ridicată devine mai proeminentă în detrimentul populației m/z scăzute. Cinetica EX1 este considerată rară în proteinele pliate în condiții native, dar poate fi indusă, de exemplu, prin adăugarea de denaturanți (Weis și colab., 2006; Oganesyan și colab., 2018). Dacă proteina revine la starea închisă la o rată mult mai rapidă decât rata de schimb chimică, se observă cinetica EX2. Aici, schimbul depinde de tranziția reziduurilor individuale între starea deschisă și cea închisă, care are loc într-un mod necorelat. Astfel, în timp, se observă o singură populație cu valori m/z în creștere treptată (Weis și colab., 2006).

în urma deuterării, reacția este stinsă la puncte de timp predefinite prin schimbarea pH-ului de la neutru (7) la pHmin (2,5–3), rezultând o reducere de ~10.000 de ori a HDX (Konermann și colab., 2011; Masson și colab., 2017; Oganesyan și colab., 2018); și prin reducerea temperaturii de la 25 la 0 CTC, ceea ce duce la o scădere de ~14 ori a HDX (Englander, 2006; Oganesyan și colab., 2018). Apoi, proteina este digerată folosind o protează și peptidele sunt separate folosind cromatografie analitică în fază inversă. În prezent, blocajul tehnic major al experimentelor HDX-MS constă în obținerea unei acoperiri de secvență ridicate, care este limitată de rezistența la enzimele digestive și de condițiile proteolitice. În cele din urmă, peptidele eluate sunt identificate folosind MS și gradul de HDX este calculat pe baza valorilor m/z obținute. Detaliile experimentale și capcanele digestiei proteinelor, separarea peptidelor și identificarea SM sunt dincolo de sfera acestei revizuiri (Konermann și colab., 2011; Masson și colab., 2017; Masson și colab., 2019).

studii de spectrometrie de masă cu Schimb de hidrogen-deuteriu ale proteinelor membranare

În ciuda împărtășirii paradigmei de acces alternativ, modificările conformaționale induse de ligand diferă între transportori datorită diferențelor în interacțiunile ligand-proteină. De exemplu, simporterii (co-transportând doi sau mai mulți liganzi) pot trece între fi și a stărilor fără liganzi legați, în timp ce legarea ligandului este obligatorie pentru schimbarea între fi și a stărilor din antiporteri (schimbul de liganzi pe laturile opuse ale membranei) (Forrest și colab., 2011; Drew și Boudker, 2016; Bai și colab., 2017).

în general, detectarea modificărilor dinamice induse de ligand local în proteine este dificilă. De exemplu, structurile cristaline ale proteinelor membranare atât în formele fără ligand, cât și în cele legate de ligand sunt frecvent indisponibile, împiedicând detectarea modificărilor conformaționale induse de ligand chiar și pentru proteinele cu structuri cunoscute. Mai mult, instantaneele structurale de înaltă rezoluție ale stărilor legate de apo și ligand pot să nu rezolve diferențe conformaționale semnificative. Cu toate acestea, mici modificări conformaționale induse de ligand pot fi detectate folosind HDX-MS la subdomenii proteice specifice în condiții native prin măsurarea absorbției diferențiale de deuteriu (XQQX) în prezența și absența liganzilor. Această abilitate a HDX-MS oferă oportunități unice pentru abordarea celor mai dificile probleme în elucidarea mecanismelor interacțiunilor ligand-proteină și proteină-proteină (Rand și colab., 2014; Masson și colab., 2019; Redhair și colab., 2019), așa cum este revizuit aici pentru o serie de proteine transportoare studiate recent.

tranziții conformaționale care stau la baza accesului alternativ: Antiporterul Na+/H+

proteinele Nha reglează pH-ul celular și volumul de-a lungul regnurilor vieții (Padan și Landau, 2016). Principalul model structural utilizat pentru studierea ortologilor Nha este Escherichia coli NhaA, pentru care este disponibilă o structură cristalografică a stării inactive la pH acid (vânătoare și colab., 2005). Pentru a studia dinamica structurală a NhaA sub pH fiziologic, HDX-MS a fost recent utilizat (Eisinger și colab., 2017). Crucial pentru informațiile obținute în acest studiu, HDX-MS oferă date dinamice globale, spre deosebire de metodele bazate pe etichetarea specifică site-ului, care detectează doar mișcările regiunilor proteice predefinite.

în acest studiu, s-a obținut o acoperire de secvență excepțional de mare de 88,5% pentru NhaA în detergent, oferind informații despre mecanismul care stă la baza accesului alternativ la legarea ligandului. Prin compararea modelelor HDX între Nha legat de APO și substrat, a fost observat un model recurent de modificare a HDX în mai multe helice, unde absorbția crescută a deuteriului într – un terminal a fost însoțită de absorbția scăzută a deuteriului la celălalt terminal. Absorbția la mijlocul elicelor a fost în mare parte neschimbată.

pe baza modelului observat de schimbare HDX, deși nu furnizează direct informații spațiale, s-a sugerat că are loc traducerea spiralelor transmembranare în raport cu membrana, așa cum se reflectă în modificările HDX reciproce observate pentru cele două capete în cadrul spiralelor transmembranare specifice. Acest model este în concordanță cu mecanismul” ascensorului ” de acces alternativ, implicând o traducere verticală a elicelor transmembranare în timpul ciclului de transport (Ryan și Vandenberg, 2016). Pe scurt, HDX-MS a oferit perspective noi asupra tranzițiilor structurale implicate în alternarea accesului, inaccesibile de structurile rezolvate anterior ale nhaa inactive.

efectul interacțiunilor proteine-lipide asupra peisajelor de Conformație ale transportatorilor

majoritatea transportorilor secundari aparțin superfamiliei facilitatorului major (MFS), împărtășind o arhitectură conservată în ciuda funcțiilor lor diverse (Radestock și Forrest, 2011). Deși structurile cristaline ale membrilor MFS sunt disponibile, acestea au furnizat puține informații despre interacțiunile proteine-lipide și efectul lor asupra echilibrului dintre stările de și IF. Astfel, Martens și colab. simulări MD combinate cu HDX-MS pentru a studia efectele mediului lipidic asupra a trei transportori bine caracterizați: permează lactoza, transportor de xiloză și antiporter glicerol-3-fosfat (Martens și colab., 2018).

În primul rând, o mutație cunoscută pentru a schimba echilibrul spre starea de a fost introdusă în vestibulul extracelular al tuturor transportorilor (Kumar și colab., 2014). Comparând WT și transportorii mutanți folosind HDX-MS a arătat că metoda detectează schimbarea conformațională, regiunile de pe vestibulul extracelular preluând mai mult deuteriu în mutanți față de WT, în timp ce opusul apare pentru reziduurile de la vestibulul intracelular. Apoi, transportorii au fost reconstituiți în nanodiscuri compuse din fosfatidilglicerol, tetraoleil cardiolipină și fie fosfatidilcolină, fie fosfatidiletanolamină. Interesant este că prezența fosfatidiletanolaminei a mutat echilibrul spre starea IF. Ulterior, simulările MD ale transportorilor în bistraturi lipidice identice cu compoziția nanodiscurilor au prezis interacțiuni directe între grupul de cap fosfatidiletanolamină încărcată și o rețea citoplasmatică conservată de reziduuri încărcate, stabilizând starea de (Doki și colab., 2013). Mutația reziduurilor încărcate a abolit efectul fosfatidiletanolaminei, sugerând cu tărie că interacțiunile specifice fosfatidiletanolamină-proteină controlează echilibrul intrinsec al transportorilor. Acest studiu este un exemplu clar de combinare a metodelor experimentale și computaționale pentru a identifica interacțiunile proteine-lipide subtile, dar semnificative din punct de vedere funcțional.

derularea helixului în timpul transportului: studii ale LeuT

LeuT este un omolog procariot al familiei neurotransmițătorilor / na+ simporteri (NSS), care include ținte importante de droguri, cum ar fi transportorii serotoninei, dopaminei și norepinefrinei (Kristensen și colab., 2011). LeuT a fost studiat pe larg, iar structurile sale cristalografice de-a lungul ciclului de transport sunt disponibile (Focke și colab., 2013). Aceste structuri au sugerat că sunt necesare rearanjări structurale la scară largă în timpul accesului alternativ (Krishnamurthy și Gouaux, 2012). Cu toate acestea, peisajul conformațional care permite tranziția între IF și state rămâne evaziv și controversat.

pentru a studia tranziția între diferite stări, Leutul solubilizat în detergent a fost investigat în condiții care favorizează Fi sau a stărilor (Merkle și colab., 2018). În mod surprinzător, multe peptide, în principal pe partea intracelulară a transportorului, au prezentat cinetica EX1. Acest lucru este destul de neobișnuit în proteinele pliate în condiții native și este considerat a reflecta o desfășurare de lungă durată a elementelor de structură secundară. Pe baza distribuției spațiale a peptidelor care prezintă cinetica EX1, împreună cu structurile cristalografice disponibile, S-a propus ca spiralele specifice să sufere o derulare parțială în timpul accesului alternativ și ca aceste modificări conformaționale să contribuie, de asemenea, la eliberarea substratului. Acest studiu evidențiază importanța funcțională a modificărilor conformaționale lente (scală de timp de secunde) care pot fi bine rezolvate folosind HDX-MS, spre deosebire de alte metode experimentale sau computaționale (de exemplu, MD).

spectrometria de masă de schimb hidrogen-deuteriu a proteinelor membranare în Nanodiscurile lipidice

interacțiunile proteinelor membranare cu lipidele din jur pot modula dramatic funcția lor (Vadas și colab., 2017). Într-adevăr, activitatea membrilor NSS eucariote depinde în mod semnificativ de interacțiunile lipid-proteine specifice care modulează dinamica proteinelor și, în consecință, interacțiunile substratului (Divito și amara, 2009). Prin urmare, Adhikary și colab. Leut studiat reconstituit în nanodiscuri cu două straturi fosfolipidice (Adhikary și colab., 2017). Folosind această abordare, LeuT a fost investigat în condiții care favorizează fi și de conformații. Comparația modelelor HDX între aceste state a evidențiat modificări specifice în regiunile implicate anterior în ciclul de transport, reflectând modificări structurale semnificative din punct de vedere funcțional. Interesant este că datele HDX-MS, în concordanță cu studiile biofizice și computaționale anterioare, au susținut un unghi de înclinare mai mic pentru prima helix transmembranar în conformația IF comparativ cu cel observat în structurile cristaline. Această diferență a fost atribuită mediului lipidic, deoarece structura cristalină a fost obținută în detergent cu o cantitate mică de lipide. Pentru a rezuma, HDX-MS oferă o platformă flexibilă pentru studierea proteinelor membranare în diferite medii hidrofobe și în condiții care favorizează stări conformaționale specifice, fără a fi nevoie de etichetare specifică site-ului.

interacțiuni ionice cu situsuri Multiple: schimbătorul Na+/Ca2+

NCX participă la homeostazia celulară Ca2+ prin extrudarea Ca2+ din celule împotriva gradientului său electrochimic (Blaustein și Lederer, 1999). Schimburile NCX 3Na+: 1Ca2+, unde Na+ și Ca2 + sunt transportate în etape separate (Khananshvili, 1990). În mod surprinzător, structura cristalină a NCX din Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) a dezvăluit patru situri de legare a ionilor, ocupate simultan de trei ioni Na+ la siturile denumite Sint, Smid, Sext și un ion Ca2+ la un sit denumit SCa (Liao și colab., 2012). Deoarece acest mod de legare a fost incompatibil cu studiile anterioare, s-au efectuat simulări MD și analize ale fluxului de ioni ale mutanților, sugerând că ionii Na+ ocupă Sint, SCa și Sext, în timp ce Ca2+ ocupă SCa (Marinelli și colab., 2014; Giladi și colab., 2016b; Giladi și colab., 2017; van Dijk și colab., 2018). Astfel, ionii Na+ și Ca2 + sunt legați într-o manieră care se exclude reciproc de-a lungul ciclului de transport.

pentru a stabili experimental atribuirea siturilor de legare a ionilor, am comparat starea apo cu stările legate de ioni ale NCX_Mj folosind HDX-MS (Giladi și colab., 2016a; Giladi și colab., 2017). În ciuda acoperirii reduse a secvenței, analiza noastră a inclus 10 din 12 reziduuri de coordonare a ionilor. Am detectat o scădere dependentă de Na + a absorbției de deuteriu la Sint, SCa și Sext, dar nu Smid, în timp ce în prezența Ca2+ scăderea absorbției de deuteriu a fost observată în principal la SCa. Acest lucru este în concordanță cu predicțiile făcute de simulările MD și analizele mutaționale care prevăd ocuparea Smid de către o moleculă de apă, dar nu de Na+ sau Ca2+ în starea de bază (Marinelli și colab., 2014; Giladi și colab., 2016a; Giladi și colab., 2017; van Dijk și colab., 2018). În special, studiile cristalografice ulterioare au validat atribuirea siturilor noastre de legare (Liao și colab., 2016). Astfel, HDX-MS a coroborat modul de legare a ionilor sugerat de studiile computaționale și funcționale.

selectivitatea ionică a unui Mutant NCX care transportă Li+

schimbătorul mitocondrial Na+ / Ca2+ (NCLX) prezintă selectivitate Ionică excepțională, schimbând Ca2+ fie cu Na+, fie cu Li+, în timp ce NCXs nu transportă Li+ (Palty și colab., 2010). Deși relevanța fiziologică a acestei selectivități ionice rămâne nedumerită, Este de remarcat faptul că 9 (din 12) reziduuri de coordonare a ionilor din NCLX diferă de cele din NCXs și alți membri ai superfamiliei antiporter de Ca2+/cation. Pentru a înțelege modul în care aceste diferențe afectează recunoașterea și transportul de legare a ionilor, am efectuat înlocuirea pe bază de structură a reziduurilor de coordonare a ionilor în NCX_Mj pentru a imita siturile de legare NCLX (Refaeli și colab., 2016). În mod izbitor, construcția nou proiectată (denumită NCLX_Mj) mediază Na+/Ca2+ și Li+/Ca2+ cu valori Km comparabile (Refaeli și colab., 2016).

în continuare, am căutat să determinăm dacă siturile de legare a ionilor din NCLX_Mj amintesc de cele ale NCX_Mj (Giladi și colab., 2019). Analizele HDX-MS ale modificărilor conformaționale induse de ioni au arătat că SCa leagă Na+, Li+ sau Ca2+, în timp ce unul sau mai multe site-uri Na+/Li+ suplimentare ale NCLX_Mj sunt incompatibile cu site-urile Na+ originale (Sext și Sint) atribuite NCX_Mj. Aceste rezultate au sugerat că NCLX_Mj poate transporta ioni cu o stoichiometrie electroneutrală de 2na+: 1ca2+sau 2LI+: 1ca2+. În concordanță cu datele HDX-MS, strângerea tensiunii accelerează cursurile de schimb Na+ / Ca2 + în proteolipozomii reconstituiți NCX_Mj (datorită unei stoichiometrii de 3Na+:1Ca2+), în timp ce nu are un efect apreciabil asupra cursurilor de schimb Na+/Ca2+ sau Li+/Ca2+ în NCLX_Mj (Giladi și colab., 2019).

studiile noastre au demonstrat utilitatea HDX-MS în identificarea și validarea situsurilor de legare în transportorii de ioni, unde diferențele relativ mici în semnalele induse de ioni de la inducerea de ioni furnizează informații importante privind selectivitatea ionilor și modificările conformaționale care apar la legarea ionilor la situsuri distincte. Astfel, combinat cu simulările MD și cristalografia cu raze X, HDX-MS este deosebit de atrăgător pentru elucidarea determinanților structurali ai selectivității ionilor și a modificărilor conformaționale induse de ioni în sistemele de transport ionic care cuprind situsuri multiple de legare a ionilor.

concluzii

în ultimele decenii, biologia structurală a contribuit enorm la înțelegerea funcției proteinelor membranare, în principal prin furnizarea de instantanee statice ale stărilor discrete la rezoluție înaltă. Pentru a descifra pe deplin relațiile structură-funcție care stau la baza procesului complex de transport al solutului, au fost dezvoltate un număr tot mai mare de metode experimentale și computaționale pentru a reduce decalajul dintre aceste instantanee statice și pentru a determina peisajele conformaționale subiacente. HDX-MS este din ce în ce mai utilizat pentru a studia proteinele membranare intacte în diferite condiții aproape native, oferind noi oportunități de a studia interacțiunile membrană-proteină, recunoașterea substratului și tranzițiile conformaționale legate de transport. Evoluțiile viitoare în instrumentație și automatizarea analizei datelor pot permite utilizarea HDX-MS în randament ridicat, exploatând pe deplin utilizarea potențială a acestuia în cercetarea de bază și în aplicațiile biomedicale, cum ar fi proiectarea medicamentelor.

contribuțiile autorului

MG și DK au revizuit literatura și au scris manuscrisul.

finanțare

această lucrare a fost susținută de Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) și de Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Sprijinul financiar acordat de premiul Shmuel Shalit DK este recunoscut cu recunoștință.

Conflict de interese

autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.