hemolizina din Escherichia coli utilizează amplificarea endogenă prin activarea receptorului P2X pentru a induce hemoliza

rezultate

hemoliza indusă de HlyA necesită activarea receptorilor Purinergici.

supernatantul de la tulpina E. coli producătoare de hemolizină (hlya) ARD6 lizează eritrocitele ecvine, umane și murine (Fig. 1). Figura 1 prezintă hemoliza indusă de HlyA în funcție de timp. Experimentele Time-lapse cu eritrocite murine și umane atașate la capace au arătat că hemoliza indusă de HlyA este un proces secvențial. În primele 20 de minute, HlyA a indus crenarea celulelor roșii din sânge ca urmare a contracției celulare, urmată de o creștere treptată a volumului și, în final, de liza celulelor (Fig. 1a și 1b, filmul S1). Această contracție secvențială și umflare se aplică și la nivelul unei singure celule. Astfel, nu sunt populații diferite de globule roșii care se micșorează sau se umflă, ci, mai degrabă, că un singur eritrocit se micșorează mai întâi și apoi se umflă ca o consecință a aplicării HlyA. Suspensia eritrocitară (1,25%) a fost incubată cu supernatant E. coli diluat (50 ecqutl · ml−1). Eritrocitele din cele trei specii testate au prezentat o diferență semnificativă în ceea ce privește capacitatea de reacție la HlyA (Fig. 1C) cu cea mai mică sensibilitate la HlyA în eritrocitele umane. În toate experimentele următoare, cantitatea de supernatant E. coli adăugat a fost ajustată pentru a produce hemoliză 50% după 60 de minute de incubare.

în general, folosim supernatant filtrat de E. coli (ARD6) pentru a induce hemoliza, dacă nu se specifică altfel. Această abordare a fost aleasă pentru a ne asigura că rezultatele noastre se vor aplica și in vivo în cazul în care HlyA este eliberat din E. coli împreună cu diverse alte componente. Cu toate acestea, atunci când am ales această abordare, a trebuit să verificăm dacă hemoliza indusă de E. coli producătoare de hlya ar putea fi de fapt atribuită HlyA. Prin urmare, am purificat HlyA din cultura noastră ARD6. După purificare, o suspensie de HlyA purificată a fost separată pe un gel de 5-15% dodecil sulfat de sodiu (SDS). O singură bandă de 100 kDa a apărut după colorarea Coomassie R, iar spectroscopia de masă a identificat banda ca HlyA (Fig. S1 A și B). Ca un control suplimentar am folosit supernatantul din tulpina E. coli D2103, o tulpină de laborator nepatologică de E. coli care nu produce HlyA. Supernatantul din aceste bacterii nu a indus hemoliza în eritrocitele umane, murine sau ecvine (Fig. S1D). Mai mult, am comparat concluziile noastre cu HlyA furnizate cu amabilitate de Prof. Sucharit Bhakdi, Universitatea din Mainz, Germania (cu activitate de 10 ng * ml−1 pentru hemoliză de 50% la sută, Fig. S2). În cele ce urmează, atunci când este menționat hlya purificat, este cu referire la acest preparat. În timpul testelor noastre inițiale ale activității biologice a HlyA, am descoperit că APIRAZA ATP-scavenger a inhibat complet hemoliza indusă de HlyA a eritrocitelor ecvine. Această constatare a fost cu adevărat surprinzătoare, deoarece a implicat ATP extracelular necesar pentru hemoliza provocată de E. coli producătoare de HlyA. Deoarece ATP extracelular este o moleculă de semnalizare care activează receptorii P2, descoperirile noastre ar putea sugera că modelul porilor predominant pentru hemoliza indusă de HlyA ar putea fi o simplificare. Prin urmare, am testat mai bine efectul curățării ATP. Am constatat că apiraza a inhibat complet hemoliza nu numai a eritrocitelor ecvine, ci și a eritrocitelor murine și umane (Fig. 2A). În plus, hexokinaza, care degradează rapid adenozin trifosfatul (ATP) la adenozin difosfat (ADP), a redus în mod similar hemoliza indusă de HlyA în celulele roșii din sânge de origine murină și umană într-o manieră dependentă de concentrație (Fig. 2B). Această constatare a fost verificată prin HlyA purificată (Fig. 2B, inserție). Este de remarcat faptul că, în eritrocitele umane, atât apiraza, cât și hexokinaza au potențat hemoliza indusă de HlyA la concentrații mai mici. Distincția ar putea sugera o diferență în modelul de expresie a receptorului P2 pe celulele roșii din sânge între specii.

pentru a valida relevanța acestei constatări, a fost important să se afle dacă antagoniștii receptorilor P2 au influențat hemoliza indusă de HlyA. Antagonistul neselectiv al receptorilor P2 PPADS a scăzut hemoliza indusă de E. coli producătoare de HlyA în eritrocitele ecvine, murine și umane (Fig. 2C). Valoarea EC50 pentru PPAD-uri a fost de 520, 400, respectiv 180, pentru eritrocitele umane, murine și ecvine. Această constatare a fost fundamentată pentru întreaga gamă de concentrații HlyA (Fig. 2D) testat în eritrocite umane expuse la HlyA purificat. Relația concentrație-răspuns a fost compatibilă cu antagonismul competitiv și trebuie remarcat faptul că efectul concentrațiilor chiar maxime de toxine a fost redus de blocantul receptorului P2. Astfel, activarea receptorului P2 pare să fie implicată în hemoliza indusă de HlyA. Antagonistul neselectiv al receptorului P2, suramina, a scăzut, de asemenea, în funcție de concentrație, hemoliza indusă de HlyA la toate cele trei specii (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, în concentrații mai mari, suramina provoacă o contracție dramatică a eritrocitelor și, prin urmare, poate să nu fie adecvată pentru evaluarea implicării receptorilor P2 în eritrocite.pentru a evalua dacă efectul antagonistului purinergic asupra hemolizei a fost doar un rezultat al osmolalității crescute, am testat efectul zaharozei extracelulare asupra hemolizei induse de HlyA (datele nu sunt prezentate). Zaharoză (1 mM) a scăzut doar ușor hemoliza (5,1% 1,7%), în timp ce 10 mm și 75 mm zaharoză a scăzut semnificativ hemoliza (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Având în vedere că concentrațiile antagoniștilor și Atpazelor utilizate în acest studiu nu au depășit niciodată 1 mM, efectul nu poate fi rezultatul creșterii osmolarității. Nici rezultatele noastre nu reflectă legarea neselectivă între antagoniști și toxină. Aceasta a fost testată pe eritrocite ecvine, care au fost preincubate cu HlyA timp de 10-15 minute la 37 IQC sau timp de 30 minute la 4 IQC, spălate temeinic și re-suspendate cu sau fără antagoniști. Deoarece HlyA este încorporat în membrană în timpul preincubării, eritrocitele au procedat la liză în absența hlya liberă. Fig. S2 arată că diferite intervenții farmacologice au redus hemoliza după ce HlyA a fost prebound la eritrocite. Antagoniștii au fost, totuși, mai puțin eficienți atunci când au fost adăugați la eritrocitele spălate în care procesul litic a fost deja inițiat.

ce Receptor(receptori) P2 este (Sunt) implicat (e) în hemoliza indusă de HlyA?

eritrocitele exprimă diferite tipuri de receptori P2. Receptorii P2 care s-au raportat a fi exprimați în eritrocitele umane mature includ P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) și P2X7 (16), în timp ce P2Y1, P2X1, P2X4 și P2X7 par a fi prezenți în celulele progenitoare eritroide (17). Pentru a testa care dintre acești receptori purinergici participă la hemoliza indusă de HlyA, am abordat receptorii în cauză individual. Deoarece receptorul P2Y1 este implicat în hemoliza indusă de sorbitol a eritrocitelor umane și murine infectate cu plasmodiu (14), Am testat dacă acest receptor a fost responsabil pentru hemoliza indusă de HlyA. Antagonistul receptorului P2Y1 MRS2179 nu a afectat hemoliza indusă de HlyA (Fig. S3A) la concentrații (până la 500 xqqm) peste ceea ce era necesar pentru a inhiba hemoliza în eritrocitele infectate cu Plasmodium berghei (14). Deoarece nu există antagoniști specifici pentru receptorii P2Y2, am examinat efectul HlyA la șoarecii transgenici. Hemoliza indusă de HlyA a fost similară în eritrocitele de la șoarecii p2y2 – / – și p2y2+ / + (Fig. S3B). În cazul p2y13 am testat antagonistul MRS2211, care a fost raportat pentru a afișa o anumită selectivitate față de receptorul P2Y13 (18). MRS2211 a scăzut semnificativ hemoliza indusă de HlyA în eritrocitele umane și murine (Fig. S3C). Această constatare contrazice rezultatele noastre cu hexokinaza (degradarea ATP la ADP), care ar trebui să stimuleze mai degrabă decât să inhibe receptorul p2y13 sensibil la ADP. Prin urmare, hexokinaza și MRS2211 ar trebui să dea rezultate opuse dacă este implicat receptorul P2Y13. Deoarece nu este cazul, receptorul P2Y13 este un candidat puțin probabil pentru receptorul P2 implicat în hemoliza indusă de HlyA. Nu putem exclude posibilitatea ca inhibarea produsă de MRS2211 să fie mediată printr-un alt receptor P2.

în principiu, acest lucru lasă doar receptorii P2X să fie luați în considerare. Fig. 3A arată că blocantul neselectiv al receptorilor P2X Evans blue a redus puternic hemoliza indusă de HlyA, sugerând că un receptor P2X este implicat în această hemoliză. Dintre receptorii P2X exprimați în eritrocite, am considerat P2X7 ca cel mai probabil mediator al hemolizei induse de HlyA din următoarele motive. Se știe că receptorii P2X7 suferă o tranziție la o stare de permeabilitate mai mare, ceea ce duce în cele din urmă la liză în anumite celule (12). S-a raportat că receptorul P2X7 interacționează cu proteina de canal pannexin1 (12), iar complexul creează un por considerabil permeabil la molecule mai mari, cum ar fi bromura de etidiu (13). Pannexin1 este exprimat în eritrocite umane (19) și a fost sugerat recent ca canal de eliberare a ATP în eritrocite (20). Pentru a testa dacă receptorii P2X7 participă la hemoliza indusă de HlyA, am folosit antagoniști cu selectivitate relativă pentru P2X7: albastru strălucitor G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehidă (OxATP) și KN-62 (21). Toți antagoniștii au scăzut hemoliza în funcție de concentrație în eritrocitele ecvine, murine și umane (Fig. 3). Eritrocitele ecvine și umane au fost mai sensibile la toate substanțele testate comparativ cu eritrocitele murine. În acest context, trebuie menționat faptul că receptorul murin P2X7 este cunoscut a fi mai puțin sensibil la KN-62 comparativ cu receptorul uman (22). Protecția împotriva hemolizei prin antagonismul receptorilor P2X a fost din nou fundamentată pentru întregul interval de concentrație de HlyA purificat în eritrocitele umane folosind BBG ca exemplu de antagonist P2X7 (Fig. 3D). Din nou, antagonistul prezintă un efect substanțial asupra hemolizei induse de HlyA chiar și sub concentrații de HlyA care au produs hemoliză maximă. Inhibarea hemolizei de către OxATP a fost verificată folosind HlyA purificat în eritrocite murine și umane (Fig. 3e, inserție). Noul antagonist selectiv, competitiv al receptorului P2X7 A438079 a redus hemoliza în eritrocitele umane, dar a fost mai puțin eficient în eritrocitele murine (Fig. 3F). Imunobloturile fracțiunilor membranei plasmatice pentru receptorul P2X7 confirmă faptul că eritrocitele umane și murine exprimă o proteină de dimensiune relevantă (66 kDa, Fig. 3G, și în întregime în Fig. S4B). Aceasta va necesita investigații suplimentare pentru a stabili pe deplin contribuția relativă a receptorilor P2X în hemoliza indusă de HlyA. Cu instrumentele noastre actuale, nu putem exclude posibilitatea contribuțiilor altor receptori P2X în hemoliza indusă de HlyA la oricare dintre speciile studiate.

Fig. S4A prezintă hemoliza indusă de HlyA în eritrocitele murine (P2X7+/+ și P2X7−/−). Eritrocitele murine prezintă un grad similar de hemoliză ca răspuns la HlyA, indiferent de genotipul lor. Șoarecii P2X7−/ – și șoarecii P2X7+/+ au fost inițial generați de Pfizer și au fost încrucișați în fundal BALB/C. Nu am detectat nicio discrepanță între sensibilitatea la hemoliza indusă de HlyA în eritrocitele izolate de la șoarecii BALB/c și c57bl/6 (datele nu sunt prezentate), chiar dacă tulpina C57BL/6 este cunoscută ca având o variație genetică în capătul C al receptorului P2X7 (23). Aceste date sunt în concordanță cu efectul minuscul al A438079 asupra eritrocitelor murine și cu expresia proteică scăzută a receptorului P2X7 în eritrocitele murine (Fig. 3F și 3G).

aceste rezultate implică faptul că există cel puțin un receptor P2 suplimentar implicat în hemoliza indusă de HlyA în eritrocitele murine. Deoarece P2X1 și P2X7 împărtășesc profiluri inhibitoare similare pentru BBG, KN-62 și OxATP (24), am testat antagoniștii P2X1 MRS2159 și NF449. MRS2159 hemoliză inhibată în funcție de concentrație în eritrocite de la cal (EC50:150 centimetric) și șoarece (EC50: centimetric 250 centimetric). Eritrocitele umane au fost relativ insensibile la antagonist, dar la o concentrație mai mare de 250 mm, s-a observat o reducere mică și semnificativă statistic (Fig. 4A). Acest efect a fost mult mai pronunțat dacă s-a utilizat hlya purificat (Fig. 4C). Aceasta implică faptul că ar putea exista diferențe în răspunsul celular în ceea ce privește dacă sunt supuși HlyA într-o formă pură sau în combinație cu alți constituenți ai E. coli. Nf449 inhibă în mod dependent de concentrație hemoliza indusă de HlyA la om (Fig. 4B). NF449 a fost mult mai puțin eficient în eritrocitele murine în acord cu receptorul murin P2X1 fiind relativ rezistent la acest inhibitor (25). Trebuie subliniat faptul că, deși nf449 este un derivat de suramină, nu a provocat aceleași modificări de volum în eritrocite ca suramina. Se știe că imunobloturile receptorului P2X1 prezintă până la 4 benzi în diferite țesuturi; o bandă non-glicozilată de 45 kDa, o bandă glicozilată de 60 kDa și o bandă de 95/120 kDa care ar putea fi forma polimerizată a receptorului (26, 27). În mâinile noastre, anticorpul receptorului P2X1 a recunoscut în mod constant o bandă de 45 KD și o bandă foarte slabă de 60 kDa în petele membranelor plasmatice din eritrocitele murine și umane (Fig. 4D). Interesant, am constatat că nivelul de Expresie 60 banda kDa a fost mult mai mare la șoarecii P2X7−/− comparativ cu controalele (similare în trei preparate, Fig. 4D). În acest imunoblot, nivelurile de proteine sunt ajustate pentru a evita supraîncărcarea benzilor de la șoarecii P2X7−/−, ceea ce lasă banda de 60 kDa aproape nedetectabilă la șoarecii P2X7+/+. Această reglare aparentă a receptorului P2X1 ar putea ascunde un fenotip hemolitic la șoarecii cu deficit de receptor P2X7. Luate împreună, aceste date susțin ipoteza că atât receptorul P2X1, cât și receptorul P2X7 sunt relevante pentru hemoliza indusă de HlyA. Rezultatele noastre indică variații semnificative între specii, în care receptorul P2X7 este mai important pentru hemoliza în eritrocitele umane.

hemoliza indusă de HlyA este prevenită de antagoniștii Pannexin1.

Carbenoxolona (28), meflochina și probenecidul (30) au fost utilizate ca antagoniști cu selectivitate relativă pentru pannexină1. Carbenoxolona a scăzut semnificativ nivelul hemolizei la toate cele trei specii cu sensibilitate similară (Fig. 5A). Efectul carbenoxolonei a fost din nou testat pentru întreaga gamă de concentrații HlyA (toxină purificată, Fig. 5B), care prezintă, de asemenea, efecte considerabile sub concentrații maxime de HlyA. Meflochina și probenecida au fost testate numai în eritrocite murine și umane. EC50 pentru meflochină a fost de 25 mmf la om și 18 MMF în eritrocite murine. Probenecidul a inhibat hemoliza în eritrocitele umane, cu un EC50 de 2 mM, dar a fost mai puțin eficace în eritrocitele murine. Recent, antagoniștii cunoscuți ai canalelor Cl-NPPB și acidul niflumic s-au dovedit a inhiba și canalele pannexinei (31). Ambele substanțe au redus hemoliza indusă de HlyA, cu un efect substanțial mai pronunțat asupra eritrocitelor umane (Fig. S5).