discuție
metoda image citometry propusă în această lucrare demonstrează capacitatea de a analiza rapid și eficient autofagia în celulele vii pentru screeningul medicamentelor potențiale care pot induce sau inhiba activitățile autofagice, cum ar fi promovarea clearance-ului proteinelor pliate greșit asociate cu neurodegenerarea sau inhibarea rezistenței la medicamente asociate cu cancerul. Limitarea metodelor actuale poate fi depășită prin citometrie de imagine și reactivi unici pentru a dezvolta o metodă nouă pentru detectarea autofagiei. Cellometer Vision a fost utilizat anterior pentru teste fluorescente pe bază de celule (Chan și colab., 2011, 2012b; Robey și colab., 2011), iar colorantul Autofagic Cito-ID s-a dovedit că colorează în mod specific autofagozomii în celulele vii. În această lucrare, se arată că colorantul Cito-ID se colocalizează cu RFP-LC3 în celulele hela înfometate, care validează în continuare specificitatea colorantului. Metoda dezvoltată de detectare a autofagiei bazată pe imagine este comparată cu citometria de flux standard prin compararea rezultatelor activității autofagiei în celulele Jurkat înfometate de nutrienți. Rezultatele au arătat o creștere a intensității fluorescente în celulele înfometate de nutrienți și o scădere a celulelor jurkat recuperate. Cu toate acestea, valorile AAF măsurate ale citometriei imaginii sunt considerabil mai mari decât citometria în flux, ceea ce s-ar putea datora diferențelor dintre instrumentație și metode. Cellometer vision image citometer folosește un dispozitiv cuplat la încărcare pentru măsurarea fluorescenței, în timp ce FACS Calibur flow citometer folosește un tub foto-multiplicator (PMT). În plus, metoda de analiză a intensităților fluorescente a diferit, de asemenea, între cele două sisteme. Citometrul de flux măsoară semnalele totale de fluorescență din fiecare celulă, în timp ce sistemul bazat pe imagini dobândește imagini și analizează autofagozomii colorați fluorescent în interiorul celulelor, ceea ce poate oferi măsurători mai precise ale activității autofagiei. Software-ul Cellometer poate analiza fluorescența celulelor prin însumarea pixelilor fluorescenți totali din fiecare celulă sau prin măsurarea numai a pixelilor cu intensitate fluorescentă ridicată din autofagozomii din fiecare celulă. O altă diferență ar putea fi cauzată de stresul de forfecare al citometriei în flux care afectează viabilitatea celulelor țintă (Robey și colab., 2011).
fluxul Autofagic este, de asemenea, un test important pentru dezvoltarea unei noi metode de detectare. CQ este utilizat pentru a inhiba degradarea lizozomală a autofagozomilor, unde activitatea autofagică ar fi cea mai mare pentru celulele Jurkat înfometate cu nutrienți în prezența CQ datorită interacțiunii sinergice dintre tratamente. Următoarea cea mai mare ar fi celulele Jurkat în foame fără CQ. Doar o ușoară creștere a activității autofagice ar fi prezentată de celulele Jurkat cu CQ numai în comparație cu controlul datorită acumulării de autofagolizozomi bazali. Rezultatele fluxului autofagic obținute de la ambele instrumente au arătat tendințe similare, dar valorile AAF măsurate în citometria imaginii sunt semnificativ mai mari. Aceste rezultate au demonstrat că metoda de detectare citometrică a imaginii ar putea fi ușor implementată pentru a examina activitatea autofagiei, în ciuda diferențelor cantitative potențial specifice instrumentului în valorile AAF.
pentru a demonstra că citometria imaginii poate fi o tehnologie potențială de screening pentru descoperirea medicamentelor, trebuie testată capacitatea de a analiza probe în mai multe condiții. Citometria imaginii este utilizată pentru a măsura activitatea autofagică a celulelor Jurkat tratate cu rapamicină la diferite concentrații, pentru a demonstra capacitatea citometriei imaginii de a măsura efectele doză–răspuns într-un studiu de timp. Ca rezultat, citometria bazată pe imagine este capabilă să detecteze diferențele de activitate autofagică în diferite condiții experimentale. În Fig. 8.6, activitatea autofagică (măsurată prin valorile AAF) este cea mai mare după 18 ore de incubație. O ușoară scădere a valorilor AAF este prezentată între 8 și 4 ore de incubație, care se poate datora faptului că nu permite celulelor să se recupereze complet după tratamentul inițial cu medicamente. În plus, celulele aderente, cum ar fi linia celulară a cancerului de prostată uman (PC-3), pot fi, de asemenea, măsurate folosind metoda citometriei imaginii. Rezoluția imagistică a viziunii Celometrului poate analiza autofagozomii marcați fluorescent (puncta), observați atât în imagini fluorescente, cât și în histograme de intensitate fluorescentă.
de asemenea, este important să se demonstreze capacitatea de a caracteriza diferiți compuși medicamentoși prin compararea efectului lor autofagic doză–răspuns pentru campaniile de descoperire a medicamentelor. Efectele doză-răspuns ale tamoxifenului și rapamicinei sunt comparate direct folosind citometria imaginii. Rezultatele la incubația de 18 ore au arătat că rapamicina a indus un nivel mai ridicat de activitate autofagică decât tamoxifenul. Este important de reținut că tamoxifenul la 100 de Centimetre este foarte citotoxic, ceea ce duce la moartea și dezintegrarea celulelor Jurkat după 18 ore de incubare. Verificarea bazată pe imagine a efectului de citotoxicitate în tamoxifen la concentrație mare poate fi foarte utilă în eliminarea incertitudinilor numai din rezultatele scatter și histogramă.
citometria imaginii a demonstrat rezultate comparabile cu citometria de flux standard pentru analiza pe bază de celule fluorescente (Chan și colab., 2011; Robey și colab., 2011). Metoda citometriei bazată pe imagini poate oferi mai multe avantaje față de citometria în flux. De exemplu, numărul de celule necesare pentru fiecare probă (10-20 xqtl) este semnificativ mai mic decât un Citometru de flux convențional (300-500 XTL). Configurarea inițială a citometrului de flux necesită utilizarea unor probe de celule țintă pentru tensiunile PMT și ajustarea compensării. Pe de altă parte, multe citometre de imagine pipetează celulele într-o cameră de numărare care poate fi rescanată de mai multe ori. Prin urmare, probele de celule țintă nu sunt irosite în timpul optimizării inițiale a ajustării timpului de expunere și a focalizării. Mai important, avantajul capturării imaginilor br și fluorescente permite cercetătorilor să verifice vizual datele de fluorescență dobândite. Acest lucru poate ajuta la identificarea citotoxicității ca efect secundar complicat al unui test de tratament medicamentos care induce autofagia.
Autofluorescența poate apărea folosind colorant autofagie Verde Cyto-ID datorită camerei de numărare din plastic, dar software-ul poate elimina automat semnalul de fundal pentru a obține fluorescența țintă reală fără a modifica calculul AAF. În plus, fotobleaching-ul sondelor fluorescente în testele pe bază de celule este minimizat, deoarece Cellometer Vision utilizează LED-uri de putere mai mici în comparație cu laserele de mare putere utilizate în alte instrumente. Îmbunătățirea viitoare a citometrului imaginii Cellometer ar fi dezvoltarea unui sistem automatizat de transfer mai mare, care poate analiza mai multe celule pentru o analiză statistică îmbunătățită, precum și capacitatea de a analiza mai multe probe simultan, facilitând screeningul medicamentos pe bază de celule cu debit mai mare al inhibitorilor și activatorilor autofagiei, apoptozei, necrozei și altor fenomene fiziologice de interes.