interacomii potențiatorilor POU5F1 și SOX2 în celulele stem embrionare umane

identificarea INTERACOMILOR potențiatori POU5F1 și SOX2

presupusele regiuni potențatoare POU5F1 și SOX2 sunt conservate evolutiv la vertebrate (44 de specii), cu semnături active ale potențiatorilor definite de semne epigenetice, cum ar fi acetiltransferază și H3K27AC, dar nu h3k27me3 în Hescs7 ( fig suplimentar. 1A). Am aplicat tehnica 4C pentru a identifica partenerii de interacțiune ai potențiatorilor putativi” momeală ” ai POU5F1 și SOX2 în linia celulară pluripotentă H9. Pe scurt, celulele au fost fixate la cromozomi de legătură încrucișată în apropiere. Cromozomii au fost apoi fragmentate prin Sonicare. Fragmentele de cromatină interacționate au fost ligate și piesele de ADN au fost purificate. Regiunile genomice care interacționează cu” momeala ” au fost apoi amplificate prin PCR imbricat (Fig suplimentar. 1b, tabelul suplimentar 1). Am proiectat primeri PCR inversi pentru a viza potențiatori presupuși ai genelor POU5F1 și SOX2. Biblioteca 4C construită a putut fi vizualizată prin electroforeză ADN, în timp ce controlul fără ligare nu a arătat aproape niciun produs PCR ( Fig suplimentar. 1B), indicând faptul că biblioteca 4C a fost amplificată din produse de ligare.

am efectuat secvențierea ADN de generație următoare folosind un secvențiator Illumina HiSeq și am clasificat interacțiunile 4C identificate fie ca interacțiuni proximale, fie distale (vezi metode). Interacțiunile distale includ interacțiuni inter-cromozomiale și interacțiuni intra-cromozomiale pe distanțe genomice mai mari de 20 kb, în timp ce interacțiunile proximale acoperă regiuni intra-cromozomiale cu distanțe genomice cuprinse între 300 bp și 20 kb. În concordanță cu rezultatele studiilor bazate pe 3C, citirile noastre de interacțiune distală reprezintă doar o mică parte din interacțiunile totale, aproximativ 10% ~ 20% pentru bibliotecile 4c ( tabelul suplimentar 2 ). Am folosit două loturi diferite de celule H9 pentru a construi bibliotecile 4c pentru POU5F1 și SOX2 independent pentru secvențierea de generație următoare. Cele două replici ale interacțiunilor distale POU5F1 și SOX2 se suprapun cu 35% și, respectiv, 25%. Acest lucru este în concordanță cu suprapunerea moderată observată în replicile biologice ale interacomilor cromatinei mediate de CTCF în celulele ES de șoarece 27 și poate reflecta diversitatea și dinamica interacțiunilor potențiatorilor, eficiența ligării, complexitatea amplificării PCR, precum și adâncimea de secvențiere. Pentru a filtra interacțiunile care probabil au rezultat din efectele stocastice, am folosit un model statistic bazat pe rata de descoperire falsă (FDR) pentru a identifica domeniile interacționate îmbogățite din întregul genom. Am fuzionat în continuare domeniile de interacțiune îmbogățite care se suprapun între replicile biologice ca fiind domenii de interacțiune frecvente de înaltă încredere. În total, au fost identificate 23 și 9 domenii de interacțiune frecventă de înaltă încredere pentru interacomii POU5F1 și , respectiv, SOX2 ( Figura 1, Tabelul suplimentar 3, 4 ) și majoritatea sunt interacțiuni inter-cromozomiale care implică regiuni bogate în gene, similare rezultatelor e4c20.

interactomii potențiatorilor POU5F1 și SOX2 se suprapun cu domeniile timpurii de replicare a ADN-ului, dar nu cu regiunile heterocromatice

am examinat în continuare dacă domeniile de interacțiune pou5f1 și sox2 (dimensiuni cuprinse între 1 Mb și 4 Mb, tabelul suplimentar 3, 4 ) au caracteristici epigenetice unice. As Ryba și colab. arătat 28, sincronizarea replicării ADN se corelează cu proximitatea spațială a cromatinei măsurată prin analiza Hi-c, sugerând că replicarea timpurie și târzie a ADN-ului apar în compartimente distincte spațial din nucleu. Am observat că locii genei POU5F1 și SOX2 se află în domeniile timpurii de replicare a ADN-ului în hESCs și ne-am întrebat dacă domeniile lor care interacționează au un timp similar de replicare a ADN-ului. Așa cum se arată în figura 2a , domeniile care interacționează cu amplificatorul POU5F1 și SOX2 se suprapun în principal cu domeniile timpurii de replicare a ADN-ului în hESCs. Distribuția valorilor de sincronizare a replicării testate în regiunile genomice care înconjoară siturile de interacțiune a potențiatorului pou5f1 și SOX2 identificate (interval de 50 kb) arată o schimbare către valori pozitive în comparație cu valorile matricei la nivel de genom (P < 2.2 10-16 pentru ambele, prin testul Wilcoxon rank-sum nepereche; figura 2b). Această observație a dezvăluit o caracteristică epigenetică interesantă, că structurile de ordin superior din jurul potențiatorilor POU5F1 și SOX2 au sincronizat sincronizarea replicării ADN-ului. Deoarece domeniile timpurii de replicare a ADN-ului au fost conectate la transcrierea genelor active în hESCs28, este probabil ca interacțiunile potențiatorilor POU5F1 și SOX2 cu regiunile distale identificate să aibă semnificație funcțională. Această observație este în concordanță cu ceea ce am văzut în pou5f1 Enhancer interactome în celulele ES de șoarece (datele nu sunt afișate). De asemenea , dezvăluit în figura 2a, domeniile de interacțiune POU5F1 și SOX2 nu se suprapun cu regiunile heterocromatice etichetate cu semnale puternice H3K9me3 în hESCs29, sugerând că interacomii se află într-o porțiune activă a genomului în ceea ce privește reglarea genei. În plus, am explorat o relație potențială cu domeniile asociate laminei nucleare (LADs) ale cromozomilor umani30, dar nu am observat nicio legătură, posibil datorită faptului că flăcăii au fost determinați în fibroblaste umane.

interacomii potențatorului sunt adiacenți siturilor de pornire a transcripției și posedă caracteristici epigenetice active

pentru a explora corelația interacțiunilor potențatorului POU5F1 și SOX2 cu locațiile genetice adnotate, am analizat distribuția distanței genomice a siturilor de interacțiune a potențatorului la cel mai apropiat situs de pornire a transcripției genei (TSS) ( figura 3A). Parcelele de densitate a nucleului atât ale site–urilor care interacționează cu amplificatorul POU5F1, cât și ale SOX2 arată clar un vârf ascuțit centrat la TSS. În comparație cu vârful de distribuție al siturilor simulate aleatoriu în întregul genom, vârfurile observate în interacomii potențiatori sunt semnificativ mai mari într-o fereastră îngustă în jurul TSS (P = 0,0018, P = 0,0047, respectiv, testul Kolmogorov-Smirnov). Îmbogățirea siturilor care interacționează în jurul TSS sugerează că potențatorii POU5F1 și SOX2 preferă interacțiunea cu regiunile genomice care conțin gene. Am investigat în continuare distribuția siturilor care interacționează cu amplificatorul POU5F1 și SOX2 în diferite regiuni genomice31. Prezentat în figura 3b , secvențele promotorului genei sunt una dintre regiunile îmbogățite atât pentru pou5f1, cât și pentru sox2 interacționator. În plus, fracția regiunilor intergenice distale este redusă în mod constant pentru cei doi interacomi. Prin urmare, observația noastră sugerează că structura cromozomială de ordin superior care înconjoară amplificatorii activi poate fi direct implicată în reglarea genelor. De asemenea, atunci când sunt selectate site-uri aleatorii în zonele timpurii de replicare a ADN-ului (vezi metode pentru detalii) pentru a compara distribuția distanței cu TSS, interacomii POU5F1 și SOX2 sunt încă mai îmbogățiți în jurul TSS, deși statistic nu sunt semnificativi (P = 0,390,1 p = 0,2098, respectiv, testul Kolmogorov-Smirnov, suplimentar Fig. 2 ).

se știe că modificarea histonei este implicată în reglarea transcripțională prin decondensarea structurilor compacte de cromatină pentru legarea factorului de transcripție. Studiile de interacțiune la nivel de genom bazate pe 3C au identificat compartimente active și inactive de cromatină în nucleu, cu compartimente active îmbogățite cu semne de histonă care activează transcrierea genei, cum ar fi H3K9ac32. Prin urmare, am întrebat dacă potențatorii activi ai POU5F1 și SOX2 interacționează selectiv cu regiunile distale care prezintă transcripția genei active. ChIP-Seq tag profile de H3K27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 și H3K36me3 în linia de celule H1 ES33 au fost utilizate pentru analiza tiparelor histonice asociate cu interactomii. Etichetele ChIP-Seq din jurul site-urilor care interacționează cu amplificatorul au fost numărate și normalizate34 și vizualizate ca boxplot. După cum sa menționat, interactomii POU5F1 și SOX2 au profiluri de intensitate mai mare de H3K4me1, H3K4me2 și H4K20me1, care sunt semne pentru reglarea activă a genelor ( figura 4a ). Comparativ cu siturile aleatorii din zonele de replicare timpurie a ADN-ului, semnele histonice investigate sunt în general mai îmbogățite în interacomul POU5F1 decât în interacomul SOX2, cu H3K4me1 și H3K9ac sunt cele mai semnificativ îmbogățite în interacomul POU5F1 (P < 2.2 10-16 pentru ambele mărci, testul Wilcoxon rank-sum nepereche). Interesant este că marca de tăcere a genei mediată de Polycomb H3K36me335 nu este îmbogățită în niciunul dintre interactomi (P = 0,485, P = 0,922, respectiv). De asemenea, am investigat relația INTERACOMILOR de potențare POU5F1 și SOX2 cu situsurile 5-hidroximetilcitozină (5-hmC) din genom. După cum a arătat un studiu anterior, site-urile genomice 5-hmC sunt îmbogățite la potențiatori activi în hESCs36. Deoarece amplificatorii din amonte POU5F1 și SOX2 sunt adiacenți site-urilor 5-hmC (în limita a 5 kb), am întrebat dacă interacomii amplificatorului sunt, de asemenea, îmbogățiți cu site-uri 5-hmC. Prezentat în figura 4B, siturile 5-hmC sunt îmbogățite În apropierea interacomilor POU5F1 și SOX2 comparativ cu siturile aleatorii din zonele de replicare timpurie a ADN-ului (p < 2.2 10-16, p = 0.047, respectiv, testul Kolmogorov-Smirnov). Astfel, cei doi interactomi de intensificare din hESCs posedă caracteristici epigenetice ale potențiatorilor activi, care pot facilita reglarea activă a transcripției genei.

(a) compararea valorilor rpkm pentru genele care interacționează (gene cu un TSS de 10 KB din siturile care interacționează) cu toate genele ansamblului uman (s-au utilizat valorile medii ale rpkm din ARN replicat-date seq în encode). (B) expresia diferențială a fost analizată pentru a compara genele interacomice în hescs și fibroblastele pulmonare fetale.

starea transcripțională a genelor care interacționează cu amplificatorul POU5F1 și sox2

pentru a înțelege starea transcripțională a genelor asociate cu amplificatorii POU5F1 și SOX2, am analizat datele transcriptomului ARN-Seq în hESCs și fibroblastele pulmonare fetale37, concentrându–ne pe genele 10 KB de site-uri care interacționează cu amplificatorul. În hESCs, expresia genelor care interacționează cu potențatorul POU5F1 și SOX2 este semnificativ mai mare decât cea a tuturor genelor din hESCs (P = 7,5 10-6 și p = 1.2 10-6, respectiv, prin testul Wilcoxon rank-sum nepereche; figura 5A), indicând faptul că interacomii sunt îmbogățiți cu gene transcrise activ. Astfel, potențatorii activi POU5F1 și SOX2 ar putea fi implicați în medierea transcripției genelor distale asociate. Analiza transcriptomului ARN-Seq a arătat, de asemenea, că genele asociate inițial cu potențatori activi POU5F1 și SOX2 în hESCs sunt reglate în jos în fibroblaste pulmonare diferențiate (P = 1,2 10-5 și, respectiv, p = 0,013, prin testul Wilcoxon rank-sum asociat; figura 5B ). Aceste rezultate indică faptul că amplificatorii acestor două gene legate de stemness interacționează cu un grup de gene care este foarte exprimat în hESCs, dar reprimat în fibroblaste.

genele distale asociate cu amplificatorul POU5F1 sunt implicate în circuitele de reglare a pluripotenței

pentru a explora dacă genele care interacționează cu amplificatorul POU5F1 și SOX2 contribuie la auto–reînnoirea și pluripotența hESCs, am analizat date dintr-un ecran de interferență ARN la nivel de genom folosind un test reporter promotor POU5F1 în hESCs38. Interferența expresiei transgenice POU5F1-GFP este cuantificată cu valori Fav care reflectă intensitatea fluorescenței GFP, ceea ce reprezintă tendința de a fi legată de stemness ( figura 6A ). În comparație cu toate genele analizate, genele care interacționează cu amplificatorul POU5F1 (genele cele mai apropiate de siturile care interacționează, cu distanța genomică de la TSS la siturile care interacționează mai mici de 10 kb) prezintă o tendință de scădere a valorilor Fav, deși statistic nu este semnificativă (p = 0,08, testul Wilcoxon rank–sum nepereche). Cu toate acestea, pentru genele care vizează SOX2, valorile Fav sunt similare cu toate genele analizate (P = 0.98, nepereche Wilcoxon rank-sum test). Prin urmare, pe baza acestor date, genele din interacțiunea POU5F1 par a fi mai importante pentru pluripotența celulelor stem decât genele din interacțiunea SOX2.

(a) corelarea genelor interacomice cu pluripotența. Genele care interacționează analizate într-un test siRNA folosind gena reporter POU5F1-GFP în hESCs au fost incluse pentru analiză. Distribuția valorilor Fav (schimbarea fluorescenței) pentru genele care interacționează sunt comparate cu toate cele 21122 de gene analizate în testul inițial. (B) analiza expresiei diferențiale a regulatorilor transcripționali identificați în hESCs și fibroblastele pulmonare fetale.

analiza ontologică a Genei39 din 39 de gene care interacționează POU5F1 și 20 de gene care interacționează SOX2 a arătat că o parte semnificativă a acestora trebuie implicată în reglarea transcripțională (30,8% și 35,0% pentru interactomii POU5F1 și SOX2, respectiv; Tabelul suplimentar 5, 6) și distribuite la 8 și 4 domenii diferite de interacțiune în interacomii POU5F1 și SOX2, respectiv, cu nu mai mult de 3 gene într-un domeniu de interacțiune. Analiza expresiei diferențiale a acestor regulatori transcripționali în hESCs și fibroblastele pulmonare fetale a relevat 9 dintre cei din interacomul POU5F1 (11 din 12 regulatori transcripționali identificați au date ARN-Seq) pentru a avea o expresie mai mare în hESCs ( figura 6b ), sugerând roluri active pentru aceste gene în rețeaua de reglementare a pluripotenței în hESCs. Pentru acei regulatori transcripționali din interacțiunea SOX2, 3 din 5 au prezentat o expresie crescută în hESCs. Prin urmare, interacomul potențator POU5F1 poate juca un rol mai mare în pluripotența celulelor stem decât interacomul potențator SOX2.

mai multe situsuri de legare a factorului de transcripție sunt îmbogățite În pou5f1 și sox2 Enhancer interactomes

legarea factorului de transcripție este una dintre caracteristicile pe care le posedă amplificatorii și poate facilita interacțiunile cromatină–cromatină pe distanțe lungi ale amplificatorului cu genele distale. Potențatorii putativi POU5F1 și SOX2 sunt puncte fierbinți cunoscute pentru asocierea mai multor proteine de legare a ADN-ului în hESCs. Pentru a înțelege dacă anumiți factori de transcripție sunt îmbogățiți în regiunile care interacționează cu amplificatorul POU5F1 și SOX2, am analizat sistematic profilurile ChIP–Seq ale proteinelor de legare a ADN-ului 32 în hESCs (vezi metode). Numărul de etichete normalizate Chip-Seq în jurul centrului site-urilor care interacționează 4C a fost calculat și vizualizat folosind boxplot ( figura 7A ). Ca control, au fost calculate și numărările din jurul centrului siturilor aleatorii din zonele timpurii de replicare a ADN-ului. Analiza statistică identificată atf3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 și YY1 situsurile au fost cele mai îmbogățite proteine în ambii interacomi potențiatori comparativ cu martor (P < 0,01, testul Wilcox rank-sum nepereche). Cu toate acestea, factorul de transcripție legat de pluripotență OCT4 nu este îmbogățit nici în interacțiunea POU5F1, nici în sox2. Prin urmare, ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 și YY1 sunt proteinele caracteristice în pou5f1 și sox2 interacționator în hESCs și prezența lor poate fi importantă din punct de vedere funcțional.

(A) Cutii de diferite proteine de legare a ADN-ului în jurul siturilor care interacționează cu amplificatorul și a siturilor aleatorii (din zonele timpurii de replicare a ADN-ului). Tag-uri ChIP-Seq în cadrul 5 kb de la un site care interacționează au fost numărate și normalizate. (B) RAD21 co-localizează cu alți factori de transcripție în interactomi. Profilurile de intensitate medie în jurul siturilor de vârf RAD21 din interacțiunea POU5F1 și SOX2 din hESCs sunt reprezentate grafic pentru factorii de transcripție ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG și YY1.

RAD21 este potențial în complex cu alți factori de transcripție pentru medierea interacțiunilor potențiatorului

așa cum se arată în figura 7a , RAD21 este una dintre proteinele îmbogățite identificate în interacomii potențiatorului POU5F1 și SOX2 în hESCs. RAD21 face parte dintr-un complex de coeziune cunoscut sub numele de reticulator cu lanț ADN. S-a demonstrat că coezina mediază bucla amplificatorului distal Pou5f1 cu promotorul genei Pou5f1 în celulele es de șoarece 40. În concordanță cu un raport anterior conform căruia Rad21 cooperează cu Ctcf și alți factori de transcripție în menținerea identității celulei es a șoarecilor40, siturile RAD21 atât în interacțiunea POU5F1, cât și în sox2 în hESCs sunt coocupate de factori de transcripție. Comploturile de agregare ilustrează în mod clar semnalele de vârf ale profilurilor de legare ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG și YY1 în centrul siturilor RAD21 din interacomii POU5F1 și SOX2 ( figura 7b ). Eliminarea Gabpa în celulele ES de șoarece este cunoscută pentru a reduce expresia Oct3/4, în timp ce supraexprimarea Gabpa menține expresia Oct3 / 4 chiar și fără LIF în cultura celulelor es de șoarece 41. Într–un ecran siRNA la nivelul genomului în hESCs38, eliminarea majorității proteinelor îmbogățite, cum ar fi RAD21, CTCF, GABPA, JUND, NANOG și YY1, a redus semnificativ expresia unui promotor transgenic POU5F1 legat de un reporter GFP, cu valori Fav ale -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, respectiv (în primele 25% din toate genele analizate). Pentru a înțelege în continuare interacțiunile cromatină–cromatină, am aplicat hibridizarea in situ fluorescentă ADN (FISH) pentru a vizualiza co-localizarea a doi loci genomici la nivelul unei singure celule. Locusul genei RARG de pe cromozomul 12 a fost identificat în interacțiunea POU5F1 în hESCs. RARG s-a dovedit recent că joacă un rol foarte important în pluripotență și poate spori inducția celulelor iPS cu două mărimi42. Un alt locus pe cromozomul 12 care nu face parte din interacțiunea POU5F1 a fost folosit ca control. Frecvența de co-localizare între locusul RARG (chr12: 51751589-51956291) și locusul POU5F1 (chr6: 31169844-31340561) s-a dovedit a fi de 1,67 ori mai mare decât frecvența dintre locusul de control (chr12: 80380971-80564119) și locusul POU5F1 (9,35% față de 5,61%, P < 0.05, suplimentar fig. 3A). Frecvența de contact mai mare dintre loci RARG și POU5F1 este în concordanță cu datele noastre de secvențiere și sugerează că se formează interacțiuni mai stabile între cei doi loci. Examinarea locilor RARG și de control (Fig suplimentar. 3B) a arătat că există mai multe rad21 și alte site-uri de legare a factorului de transcripție în locusul RARG cu co-localizare frecventă. Coincidența frecvenței interacțiunii cromozomiale cu situsurile de legare care conțin RAD21 pentru mai mulți factori de transcripție sugerează că RAD21 poate coopera cu alți factori de transcripție pentru a organiza interacțiuni cromatină-cromatină pe distanțe lungi. Astfel, RAD21, împreună cu mai mulți factori de transcripție, este probabil să contribuie la structura cromozomială de ordin superior care înconjoară amplificatorii POU5F1 și SOX2 în hESCs ca parte a unei rețele de pluripotență. Cu toate acestea, sunt necesare studii moleculare suplimentare pentru a confirma această ipoteză derivată din studiul 4c-Seq.