- rezumat
- 1. Introducere
- 2. Materiale și metode
- 2.1. Animale
- 2.2. Culturi celulare
- 2.3. Testul de colorare a imunofluorescenței
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Cantitativ (în timp real) reacția în lanț a polimerazei (PCR în timp Real)
- 2.6. Analiza statistică
- 3. Rezultate
- 3.1. Distribuția astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 în diferite regiuni cerebrale
- 3.2. Morfologiile astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 Irak în diferite regiuni cerebrale
- 3.3. Colocalizarea NDRG2, GFAP și S100 în astrocite în diferite regiuni cerebrale
- 3.4. Expresia proteinelor NDRG2, GFAP și S100, în diferite regiuni cerebrale
- 4. Discuție
- disponibilitatea datelor
- dezvăluirea
- conflicte de interese
- contribuțiile autorilor
- mulțumiri
- materiale suplimentare
rezumat
astrocitele posedă caracteristici morfologice diferite în funcție de regiunea cerebrală în care se găsesc. Cu toate acestea, niciunul dintre markerii astrocitici actuali nu poate eticheta cu succes toate subpopulațiile. Astfel, identificarea markerului adecvat pentru o investigație științifică specifică este critică. Aici, am comparat distribuția și expresia proteică a trei markeri astrocite: NDRG2, GFAP, și S100, în cortex, hipocampus și talamus. Astrocitele NDRG2 și S100 au fost distribuite mai uniform decât astrocitele GFAP pozitive în întregul creier. IMUNOREACTIVITĂȚILE NDRG2 și S100 au fost cele mai puternice în cortexul dorsal și talamus, în timp ce imunoreactivitatea GFAP a fost cea mai puternică în hipocamp. Mai mult decât atât, nivelurile de expresie a proteinelor de NDRG2, GFAP și S100 XV la șoarecii adulți au fost cele mai ridicate în cortex, hipocamp și, respectiv, talamus. De asemenea, am detectat morfologia astrocitelor și am constatat că, în corpul calos și pedunculul cerebral, s-au găsit astrocite pozitive GFAP cu procese mai numeroase și mai lungi decât astrocitele pozitive NDRG2 și S100. Aceste rezultate demonstrează că NDRG2 și S100 sunt utilizate mai adecvat pentru a vizualiza distribuția generală și modificările numărului de astrocite, precum și pentru a eticheta astrocitele din cortex și talamus. Cu toate acestea, GFAP este utilizat mai adecvat pentru a eticheta astrocitele din corpul calos, pedunculul cerebral și hipocampul. Aceste rezultate ajută la ghidarea cercetătorilor în alegerea markerului astrocitar adecvat și sugerează diferențe în calitățile imunologice ale astrocitelor pe baza țesutului în care se găsesc.
1. Introducere
astrocitele au fost mult timp considerate celule auxiliare care oferă doar suport trofic, metabolic și structural neuronilor . Cu toate acestea, în ultimii ani, cercetări ample au arătat că acestea joacă roluri cruciale în funcțiile fiziologice și patologice cerebrale. Astrocitele ajută la menținerea homeostaziei ionice și a barierelor hemato-cerebrale, la formarea și îndepărtarea sinapselor, precum și la controlul fluxului sanguin cerebral și la reglarea reciclării neurotransmițătorilor, a excitotoxicității glutamatului și a stresului antioxidant . Important, astrocitele posedă diversități morfologice, populaționale și funcționale în diferite regiuni cerebrale . Prin urmare, identificarea markerului cel mai potrivit pentru subgrupurile polimorfe și multiple de astrocite este esențială pentru cercetarea multifuncției astrocitice.
proteina acidă fibrilară glială (GFAP) este cel mai frecvent utilizat marker astrocitic, dar ca filament intermediar major care compune citoscheletul, GFAP a imunomarcat doar aproximativ 15% din volumul total de astrocite și mai mult de 40% din astrocite s-au dovedit a fi GFAP-negative în hipocampul șobolanului adult . În plus, GFAP a etichetat astrocitele umane protoplasmice slab și a fost exprimat târziu în dezvoltarea astrocitelor fibroase .
un alt marker astrocytic utilizat în mod obișnuit este S100 XV, o peptidă de legare Ca2+ abundentă în citoplasmă și nucleul astrocitelor care este implicat în reglarea ciclului celular și modificarea citoscheletului . Cu toate acestea, S100 XV este exprimat și într-o subpopulație de oligodendrocite mature, în celulele epiteliale ale plexului coroid și în câțiva neuroni . Deficiențele GFAP și S100 în etichetarea astrocitelor pot duce la inexactități sau chiar greșeli în explorarea funcțiilor astrocitelor.
gena n-Myc reglementată în aval 2 (NDRG2) a fost descoperită pentru prima dată într-o bibliotecă normală de ADNc cerebrală umană printr-o metodă de hibridizare substractivă bazată pe PCR . Este un supresor tumoral și o genă legată de stresul celular asociată cu proliferarea și diferențierea celulelor . NDRG2 este exprimat pe scară largă în cortexul cerebral, bulbul olfactiv, midcerebral, hipocampus și talamus . Cel mai important, NDRG2 este exprimat în mod specific în astrocite ale creierului . Astfel, NDRG2 este privit ca un marker astrocitic nou, în special pentru astrocitele mature, nereactive și neproliferante . Cu toate acestea, nu a fost raportat dacă NDRG2 este mai fiabil decât GFAP și S100 ca marker astrocitic, precum și diferențele de distribuție și exprimare a acestora în diferite regiuni cerebrale.
în studiul actual, am comparat distribuția, expresia proteinelor și colocalizarea reciprocă a markerilor astrocitici NDRG2, GFAP și S100 în întregul creier al șoarecilor. Ne-am propus să identificăm cel mai potrivit marker pentru astrocite în diferite regiuni cerebrale.
2. Materiale și metode
2.1. Animale
șoareci masculi tineri, adulți și bătrâni c57bl / 6 în vârstă de 1 lună, 3 luni, 6 luni, 9 luni și 12 luni au fost obținute de la Centrul experimental pentru animale al Universității Central South. Animalele au fost libere să mănânce și să bea, ținute la o temperatură de 25 de la 1 la 1 la și adăpostite cu un cerc de lumină-întuneric de 12:12 ore pentru a simula ritmul circadian al animalului. S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința animalelor și pentru a reduce numărul de animale utilizate. Toate procedurile experimentale pe animale au urmat un protocol aprobat de Comitetul etic pentru experimentarea pe animale al Central South University Animal Care and Use Committee, China.
2.2. Culturi celulare
celulele HT22 (o linie celulară neuronală) și celulele MA1800-57 (o linie celulară astrocitară) au fost cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM, HyClone) conținând 10% ser fetal bovin (FBS, Gibco), 50 U/mL penicilină și 50 hectolitri / mL streptomicină. Celulele OLN-93 (o linie celulară oligodendroglială) au fost păstrate în DMEM suplimentat cu 10% FBS, glutamină 2 mM, penicilină 50 U/mL și streptomicină 50 hectog/mL. Toate celulele au fost menținute la 37 de grade C într-un amestec de 95% aer atmosferic și 5% CO2. Celulele HT22, celulele OLN-93 și celulele MA1800-57 au fost însămânțate pe diapozitive și au fost colorate cu anticorpi împotriva proteinei 2 asociate microtubulilor (MAP2), a tubulinei de la XV și, respectiv, a GFAP.
2.3. Testul de colorare a imunofluorescenței
după ce șoarecii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (50 mg / kg), cerebrele lor au fost extrase și fixate cu 0,9% soluție salină heparinizată rece și 4% paraformaldehidă. După postfixare, cerebrele au fost deshidratate succesiv în soluții de zaharoză 20% și zaharoză 30%. Secțiunile cu grosimea de 10 mm au fost preparate cu ajutorul unui feliator congelat Leica CM1900. Secțiunile cerebrale au fost incubate în 1% H2O2 timp de 15 min și 0,3% Triton X-100 timp de 15 min, cu 3 spălări în PBS postincubare între fiecare tratament. Secțiunile au fost apoi blocate în ser normal de capră de 5% timp de 1 oră la temperatura camerei și incubate peste noapte la 4 centi C într-o cutie de umidificare cu anticorpi primari după cum urmează: anticorp anti-GFAP de șoarece (#3670, 1:500, tehnologie de semnalizare celulară); anticorp anti-NDRG2 de iepure (#5667, 1:200, tehnologie de semnalizare celulară); anticorp anti-NDRG2 de șoarece (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); anticorp anti-S100#2017-1, 1:500, epitomică); anticorp anti-glutamină sintetază (GS) de șoarece (#mab302, 1:200, Millipore); anticorp anti-map2 de iepure (#ab32454, 1:500, abcam); și anticorp anti-tubulină de șoarece (#T6199, 1:500, Sigma). Apoi, secțiunile au fost incubate cu amestecuri de Alexa-488 (verde, Invitrogen) și Alexa-647 (roșu, Invitrogen)-anticorpi secundari conjugați măgar anti-iepure sau măgar anti-șoarece timp de 2 ore în întuneric la temperatura camerei. 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) a fost utilizat pentru colorarea nucleelor. Secțiunile au fost montate cu 50% glicerol. În cele din urmă, secțiunile au fost vizualizate și fotografiate folosind un microscop fluorescent Olympus Bx51 (Japonia). Anticorpii utilizați în studiul nostru au fost utilizați pe scară largă în studiile noastre anterioare și de către alți investigatori , iar sensibilitatea și specificitatea acestor anticorpi au fost confirmate.
2.4. Western Blot
cortexul, hipocampul și talamusul au fost colectate de la șoareci C57BL / 6 în vârstă de 1 lună, 3 luni, 6 luni, 9 luni și 12 luni. Probele au fost omogenizate în tampon RIPA, iar concentrația probelor de proteine a fost măsurată prin kitul de testare a proteinelor BCA (Pierce Biotechnology, US). Probele de proteine au fost separate de 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE gel kit, Cw0022s, China) și transferate electric în membrane de difluorură de poliviniliden (PVDF). Componentele kitului de Gel SDS-PAGE au inclus 30% ACR-Bis, tampon de gel de separare a paginilor SDS, tampon de gel de stivuire a paginilor SDS, APS (persulfat de amoniu) și TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamină). Ulterior, membranele au fost blocate în 5% lapte uscat degresat diluat în TST (TBS cu 0,05% între 20) Timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi incubate cu anticorpi primari specifici: anticorp anti-GFAP de șoarece (#3670, 1:1000, tehnologie de semnalizare celulară); anticorp anti-NDRG2 pentru iepuri (#5667, 1:1000, tehnologie de semnalizare celulară); anticorp anti-S100 pentru iepuri (#2017-1, 1:1000, Epitomică); și anticorp anti-gapdh pentru iepuri (#5174, 1:1000, tehnologie de semnalizare celulară) peste noapte la 4 C. membranele au fost apoi incubate cu un anticorp secundar anti-iepure sau anti-șoarece conjugat, SUA) timp de 2 ore. semnalele Chemiluminescente au fost dezvoltate folosind reactivul chemiluminescență Western Lightning plus (științele vieții perkinelmer; Wellesley, MA) și detectat de un analizor de imagine LI-COR Odyssey System (li-COR Biotechnology, SUA). Imunoreactivitatea benzilor proteice a fost analizată cantitativ de Bio-Rad Laboratorul de imagini de la seria de produse software de la seria de produse Bio-Rad. Valorile densității benzii au fost normalizate la GAPDH.
2.5. Cantitativ (în timp real) reacția în lanț a polimerazei (PCR în timp Real)
cortexul, hipocampul și talamusul au fost colectate de la șoareci C57BL/6 în vârstă de 1 lună, 3 luni, 6 luni, 9 luni și 12 luni. ARN-ul Total a fost izolat folosind un kit TransZol Up Plus ARN (Cod nr. ER501-01, Transgen, China) și cuantificate folosind un NanoDrop 2000. Apoi, 1000 ng de ARN total a fost transcris invers într-o reacție de 20 ilict la 42 ilict C timp de 15 min, urmată de 85 ilict C timp de 5 sec folosind un Transscript Ilict All-in-One de sinteză a ADNc de primă catenă SuperMix pentru qPCR (Cod nr. AT341, Transgen, China). Componentele kit inclus un 5×TransScript® All-in-One SuperMix pentru qPCR (TransScript® RT, RNase Inhibitor, Ancorat Oligo(dT)18 Grund, Aleatoare Grund(N9), dNTPs, tampon), 5×TransScript® All-in-One Nu-RT Control SuperMix pentru qPCR, un gDNA de Demontare și o RNase-apă gratuită. 5×TransScript® All-in-One Nu-RT Control SuperMix pentru qPCR a fost folosit ca un control negativ. PCR în timp Real a fost efectuat într-o reacție de 20 de unqql conform manualului producătorului pentru TransStart Tip Green Qrna SuperMix (Cod nr. AQ141, Transgen, China). Secvențele de grund ARNm utilizate pot fi găsite în tabelul 1. Reacția s-a efectuat la 94 CTC timp de 30 sec urmată de 40 de cicluri de 94 CTC timp de 5 sec, 60 CTC timp de 15 sec și 72 CTC timp de 19 sec pe sistemul ViiA7 de detecție PCR în timp real (2720 Cicler termic, biosisteme aplicate). Primerii și secvențele derivate din expresia relativă a ARNm au fost analizate folosind formula .
|
||||||||||||||||||||||||
2.6. Analiza statistică
testele statistice au fost efectuate cu ajutorul software-ului PRISM v7.0 (GraphPad). Comparațiile dintre două grupuri au fost efectuate folosind testele T ale elevilor. Comparațiile între diferite grupuri au fost efectuate folosind ANOVA unidirecțională cu posttestul lui Tukey. Toate valorile au fost prezentate ca valori medii ale SD. Valorile p<0,05 au fost considerate semnificative statistic.
3. Rezultate
3.1. Distribuția astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 în diferite regiuni cerebrale
regiunile creierului șoarecilor au fost identificate prin etichetarea nucleelor celulare. În plus, a fost utilizat un atlas corespunzător al creierului mouse-ului pentru a verifica regiunile specifice analizate (Figura 1). Apoi am folosit colorarea imunofluorescenței pentru a detecta distribuția astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 XV în diferite regiuni cerebrale ale șoarecilor masculi adulți în vârstă de 6 luni. Astrocitele NDRG2 și S100 au fost mai abundente și mai uniform distribuite decât astrocitele GFAP pozitive pe întregul creier (Figura 2). Astrocitele NDRG2-pozitive au fost concentrate în cortexul dorsal (Regiunea 1) și talamus (Regiunea 5), dar mai puțin în hipocampus (regiunea 4), corpus callosum (Regiunea 3) și cortexul ventral (Regiunea 2) și cel mai puțin în pedunculul cerebral (Regiunea 6) (figurile 2(a) și 2(b)). Astrocitele GFAP-pozitive au fost concentrate cel mai mult în hipocamp; mai puțin au fost detectate în corpul calos și pedunculul cerebral și aproape nedetectabile în cortexul dorsal, cortexul ventral și talamus (figurile 2(a) și 2(c)). Astrocitele S100-pozitive au fost concentrate cel mai mult în cortexul dorsal și talamus, mai puțin în hipocampus și cortexul ventral și cel mai puțin în pedunculul cerebral și corpul calos (figurile 2(b) și 2(c)). Distribuția astrocitelor NDRG2-pozitive a fost similară cu cea a astrocitelor S100-pozitive pentru S100.
(a)
(a)
(B)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
astrocitele din diferite regiuni cerebrale au prezentat imunoreactivități inegalabile la NDRG2, GFAP și S100 (Figura 2). Astrocitele din cortexul dorsal și talamusul au reacționat puternic la NDRG2 și S100 inkt, dar slab la GFAP. Astrocitele din hipocampus au reacționat puternic la GFAP și moderat la Ndrg2 și S100 XV. Astrocitele din cortexul ventral, corpus callosum și pedunculul cerebral au reacționat slab până la moderat la NDRG2, GFAP și S100 (Tabelul 2).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
+++: puternic pozitiv; ++: moderat pozitiv; +: slab pozitiv.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distribuția astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 în diferite regiuni cerebrale ale șoarecilor masculi a fost similară cu cea a șoarecilor masculi bătrâni (12 luni) (Figura 3).
3.2. Morfologiile astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 Irak în diferite regiuni cerebrale
astrocitele sunt împărțite în principal în două tipuri: astrocite fibroase în materie albă și astrocite protoplasmice în materie cenușie. Prin urmare, am comparat morfologiile celor două tipuri etichetate prin markeri diferiți în corpul calos (materia albă, Regiunea 3) și hipocampul (materia cenușie, regiunea 4) (Figura 4). Rezultatele obținute de la șoarecii masculi adulți (6 luni) au arătat că astrocitele NDRG2 și S100 au prezentat o formă stelată caracterizată prin soma mare și rotundă, împreună cu procese citoplasmatice scurte și grosiere care au avut puține ramuri. Astrocitele GFAP-pozitive au prezentat o formă radială caracterizată prin soma mică, procese lungi și multiramuri (Figura 4). Mai mult, în corpus callosum și peduncul cerebral, astrocitele etichetate de GFAP au prezentat procese mai abundente mai lungi decât cele etichetate de NDRG2 și S100 (figurile 5 și 7).
3.3. Colocalizarea NDRG2, GFAP și S100 în astrocite în diferite regiuni cerebrale
NDRG2 a fost aproape colocalizată cu GFAP în astrocite ale cortexului ventral, corpus callosum și peduncul cerebral și, în cea mai mare parte, colocalizată cu GFAP în astrocite ale hipocampului (figurile 5 și 8(a)). NDRG2 nu a avut aproape nicio colocalizare cu GFAP în astrocitele cortexului dorsal și talamusului (Figura 5). NDRG2 și S100 au prezentat o colocalizare aproape completă în astrocite din cele șase regiuni cerebrale(figurile 6 și 8 (b)). GFAP și S100 au prezentat o colocalizare semnificativă în astrocitele cortexului ventral, corpus callosum și peduncul cerebral și o colocalizare aproape completă în astrocitele hipocampului (Figura 7). GFAP și S100 au avut aproape nici o colocalizare în astrocite ale cortexului dorsal și talamus (Figura 7).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
am detectat, de asemenea, colocalizarea NDRG2 și a unui alt producător astrocitic, glutamină sintetază (GS), în astrocitele cerebrului șoarecilor. NDRG2 și GS au avut o colocalizare semnificativă în astrocite (figura s1a). NDRG2 și GS au prezentat o colocalizare aprofundată în astrocitele fibroase ale corpului calos și în astrocitele protoplasmice ale hipocampului (figura S1B). Expresia proteinei NDRG2 în celulele HT22 ale liniei celulare neuronale, celulele OLN-93 ale liniei celulare oligodendrogliale și celulele ma1800-57 ale liniei celulare astrocite au fost, de asemenea, detectate (figura s2). Proteina NDRG2 a fost detectată în celulele MA1800-57 și abia a fost detectată în celulele HT22 și celulele OLN-93 (figurile S2A și S2B).
3.4. Expresia proteinelor NDRG2, GFAP și S100, în diferite regiuni cerebrale
am folosit western blotting pentru a detecta nivelurile de Expresie ale proteinelor Ndrg2, GFAP și S100, în trei regiuni cerebrale ale șoarecilor masculi adulți (6 luni): cortexul, hipocampul și talamusul (figura 8(c)). Am analizat nivelurile de Expresie ale acestor markeri în aceeași regiune cerebrală (figura 8(d)). În cortex, nivelul expresiei NDRG2 a fost semnificativ mai mare decât nivelurile de Expresie GFAP și S100 (p<0,001, p<0,05). De asemenea, nivelul de Expresie al S100-ului a fost mult mai mare decât GFAP (p<0,05). În hipocampus, nivelul expresiei GFAP a fost mai mare decât NDRG2 și S100 (p<0.01), iar nivelul expresiei NDRG2 a fost puțin mai mic decât nivelul expresiei S100 la sută, deși diferența nu a fost semnificativă statistic. În talamus, nivelul de Expresie al S100 XV a fost semnificativ mai mare decât nivelurile de Expresie GFAP și NDRG2 (p<0,01), în timp ce nivelul expresiei NDRG2 a fost similar cu cel al GFAP.
în continuare, am analizat nivelurile de Expresie ale aceluiași marker în diferite regiuni cerebrale (figura 8(e)). Nivelul expresiei NDRG2 în cortex a fost mult mai mare decât în hipocamp și talamus (p<0,01) și nu s-a observat nicio diferență semnificativă între hipocamp și talamus. Nivelul expresiei GFAP în hipocamp a fost cel mai ridicat dintre cele trei regiuni (p<0,001, p<0,01); nu s-a observat nicio diferență semnificativă între cortex și talamus. Nivelul expresiei S100 în talamus a fost semnificativ mai mare decât în cortex și hipocampus (p<0.01), fără nicio diferență semnificativă între ultimele două.
am detectat, de asemenea, nivelurile de proteine ale NDRG2, GFAP și S100 Inksqu în cortexul, hipocampul și talamusul șoarecilor masculi în vârstă de 1 lună, 3 luni, 6 luni, 9 luni și 12 luni (figurile 9(a)-9(f)). Nivelurile de proteine ale NDRG2 și GFAP din cortex, hipocamp și talamus au crescut treptat odată cu vârsta (p<0,05, p<0,01). Nivelurile de proteine ale S100-ului în cortex și talamus, dar nu și în hipocampus, au crescut treptat odată cu vârsta (p<0.05, p<0,01, p<0,001). Nivelurile de ARNm ale NDRG2, GFAP și S100 Inksqu în cortexul, hipocampul și talamusul șoarecilor masculi în vârstă de 1 lună, 3 luni, 6 luni, 9 luni și 12 luni au fost în concordanță cu cele ale nivelurilor de proteine (p<0,05, p<0,01, figurile 9(g)-9(i)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Discuție
în acest studiu, am constatat că astrocitele etichetate de NDRG2 și S100 au fost distribuite mai larg și mai uniform decât cele etichetate de GFAP în întregul creier al șoarecilor tineri, maturi și bătrâni. Acest lucru sugerează că NDGR2 și S100 sunt markeri mai adecvați pentru a observa distribuția generală și modificările numărului de astrocite. Mai mult decât atât, rezultatele noastre au arătat că astrocitele din diferite regiuni cerebrale au prezentat niveluri diferite de imunoreactivitate la NDRG2, GFAP și S100, ceea ce sugerează că, în cortex și talamus, Ndrg2 și S100, sunt markeri astrocitici mai adecvați decât GFAP. Imunoreactivitatea inegalabilă a astrocitelor la NDRG2, GFAP și S100 XV s-ar putea datora, de asemenea, sensibilității și specificității anticorpilor pe care i-am utilizat. În plus, morfologiile astrocitelor etichetate de NDRG2 și S100 au fost similare între ele, dar au fost evident distincte de cele etichetate de GFAP, deoarece acești markeri au marcat diferite structuri citoscheletice. NDRG2 pătează citoplasma și membranele celulare și pătează slab nucleul . GFAP colorează în principal soma și procesele, dar nu și nucleul, în timp ce S100 XV colorează nucleul și o parte din citoplasmă și procese . Comparând morfologiile astrocitelor etichetate de NDRG2, GFAP și S100 XV, am constatat că GFAP a fost un marker mai potrivit pentru astrocitele din corpul calos, pedunculul cerebral și, în special, hipocampul. Proteinele NDRG2 și S100 au fost exprimate cel mai mult în cortex și respectiv talamus. Deducem că NDRG2 este mai potrivit pentru astrocitele din cortex, în timp ce S100 Irakt este mai potrivit pentru astrocitele din talamus atunci când cuantifică densitatea astrocitică. Diferitele tipare de expresie a proteinelor din NDRG2, GFAP și S100 Irak în cortex, hipocamp și talamus au confirmat eterogenitatea funcțională astrocitică.s-a constatat că astrocitele joacă un rol important în menținerea homeostaziei și participă activ la aproape toate tulburările neurologice, cum ar fi accidentele vasculare cerebrale ischemice, leziunile cerebrale traumatice, boala Alzheimer și boala Parkinson . S-a demonstrat că morfologia astrocitică, expresia genelor și funcția diferă între diferite regiuni ale cerebrului . Astrocitele fibroase și astrocitele protoplasmice sunt două subpopulații majore identificate prin morfologia lor . Astrocitele fibroase au procese lungi, subțiri și un aspect asemănător stelelor, în timp ce cele protoplasmice au numeroase procese fine, care contactează și sinapsează teaca . Interesant este că multe gene sunt exprimate eterogen prin subseturi de astrocite. Aceste gene codifică proteine , cum ar fi transportorii de glutamat și canalele ionice , precum și receptorii de glutamat , dopamină și opioide .
eterogenitatea expresiei genelor implica diversitatea funcțională a astrocitelor. De exemplu, absorbția glutamatului diferă între diferite subseturi . În plus, oscilațiile spontane de calciu diferă între diferite straturi ale cortexului somatosenzorial. Astrocitele stratului Cortical 1 au prezentat activitate Ca2 + asincronă frecventă, în timp ce astrocitele stratului 2/3 au prezentat activitate Ca2+ sincronă rară . În cortex, astrocitele răspund la glutamat și norepinefrină cu creșteri ale calciului, în timp ce astrocitele hipocampale prezintă răspunsuri de calciu la ATP, GABA, glutamat, acetilcolină, prostaglandine și endocanabinoide . Studiile au arătat, de asemenea, că astrocitele cultivate din diferite regiuni ale creierului au capacități diferite de a stimula creșterea și ramificarea neuritelor . Deoarece astrocitele din diferite regiuni ale creierului prezintă caracteristici diferite ale morfologiei și funcției, identificarea celui mai potrivit marker pentru astrocite în diferite regiuni cerebrale este crucială pentru cercetătorii astrocitici.
deși mai multe proteine au fost raportate ca fiind exprimate selectiv de astrocite, niciuna nu s-a dovedit a fi limitată în totalitate la toate subtipurile astrocite. GFAP, cel mai utilizat marker astrocitic, este exprimat preferențial în astrocite de materie albă față de cele de materie cenușie și nu reușește să eticheteze toate procesele astrocitelor . Mai important, există subseturi de astrocite negative GFAP care prezintă curenți k+ dependenți de tensiune, în timp ce astrocitele pozitive GFAP prezintă modelul clasic al curenților independenți de timp și tensiune .
studiile anterioare au constatat că S100 a fost capabil să eticheteze astrocitele atât în materia cenușie, cât și în cea albă; cu toate acestea, a fost exprimată și în câteva oligodendrocite și neuroni . S100 s-a constatat că s-a exprimat cel mai mult în astrocitele talamusului, un subtip de celule care participă la curățarea resturilor Daergice produse de degenerarea terminalelor Daergice în boala Parkinson prin facilitarea prezenței lizozomilor și formarea autofagozomilor . Analiza transcriptomică a astrocitelor a identificat familia aldehidă dehidrogenază 1, membru L1 (ALDH1L1), ca marker astrocitic . Cu toate acestea, ALDH1L1 a etichetat și oligodendrocite . În mod similar, transportorii de aminoacizi excitatori transportor glutamat/aspartat (GLAST), glutamină sintetază (GS), transportor de glutamat-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, aquaporin 4 și glicoproteina CD44 de suprafață celulară au avut, de asemenea, limitări la etichetarea astrocitelor .
NDRG2 este exprimat în mod specific în astrocite atât la șobolani, cât și la șoareci și este asociat cu creșterea și maturarea creierului embrionar în curs de dezvoltare . În plus față de proliferarea celulară, diferențierea și transporturile transmembranare, NDRG2 participă, de asemenea, la răspunsurile la stres, depresie, boli ischemice și tulburări neurodegenerative . La șoareci și oameni, NDRG2 participă la dezvoltarea tulburării de deficit de atenție/hiperactivitate (ADHD), o boală asociată cu Centrul de locomoție din cortexul cerebral . Flugge și colab. a detectat expresia NDRG2 în cerebrele oamenilor, marmosetelor, rechinilor de copaci, șobolanilor și șoarecilor și a sugerat că NDRG2 a fost un nou marker astrocitic, în special pentru astrocitele mature, nereactive și neproliferante . În acest studiu, am detectat pentru prima dată modelul de distribuție a astrocitelor NDRG2-pozitive în diferite regiuni cerebrale și diferențele cu astrocitele etichetate de markerii clasici GFAP și S100 XV.
astrocitele și markerii astrocitici s-au schimbat în timpul îmbătrânirii normale a creierului. Lucrările anterioare au arătat că astrocitele sunt activate la începutul îmbătrânirii, iar creșterea semnificativă a astrocitelor pozitive GFAP a fost găsită în regiunile hipocampale ale șoarecilor în vârstă . Nivelurile atât ale proteinei GFAP, cât și ale ARNm GFAP au crescut în diferite părți ale creierului îmbătrânit, cum ar fi cortexul cerebral, hipocampul și cerebelul . Discrepanțele rămân în rândul diferitelor rapoarte ale S100 XV în creierul îmbătrânit . Din ce în ce mai mult, studiile au arătat că NDRG2 este asociat cu tulburări legate de vârstă, cum ar fi boala Alzheimer. În studiul nostru, nivelurile de ARNm GFAP și NDRG2 în cortex, hipocamp și talamus au crescut treptat odată cu vârsta, în timp ce nivelurile de ARNm S100 în hipocamp și talamus au crescut odată cu vârsta, dar nu și în cortex.
trebuie remarcat faptul că, în prezent, mulți markeri în plus față de cei pe care i-am testat, cum ar fi ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 și vimentin, sunt utilizați pentru a eticheta astrocitele. În studiul nostru, am comparat doar astrocitele cerebrale clasice etichetate de noul marker propus NDRG2 și markerii cei mai frecvent utilizați: GFAP, S100, și GS în creier.
În concluzie, studiul nostru indică faptul că NDRG2 și S100 Inktv sunt markeri mai adecvați pentru astrocitele din cortex și, respectiv, talamus, precum și pentru observarea distribuției globale și a modificărilor numărului de astrocite în creier. Între timp, GFAP este superior NDRG2 și S100 la etichetarea proceselor și ramurilor astrocitelor din corpul calos, pedunculul cerebral și, în special, hipocampul. Studiul nostru arată importanța alegerii celui mai potrivit marker pentru astrocite în diferite regiuni cerebrale ale șoarecilor, care oferă îndrumări cercetătorilor în neuroștiințe atunci când explorează funcțiile astrocitice.
disponibilitatea datelor
datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt incluse în articol.
dezvăluirea
Zengli Zhang și Zhi Ma sunt co-primii autori.
conflicte de interese
autorii declară că nu au conflicte de interese.
contribuțiile autorilor
Zengli Zhang și Zhi Ma au contribuit în mod egal la acest studiu.
mulțumiri
această lucrare a fost susținută de Fundația pentru științe Naturale din Beijing (nr. 7194321 către Lixia Zhang), Fundația Națională pentru științe Naturale din China (nr. 81801138 către Yulong Ma, nr. 81771206 către Wangyuan Zou), subvenția de cercetare pentru tineri cercetători a Asociației Anesteziste Chineze (nr. 21700001 către Yulong Ma), Fundația Miaopu spitalul general (nr. 18kmm47 la Lixia Zhang), și știința Municipal Beijing & Comisia tehnologie (no. 1811000017180022 să stea Guo).
materiale suplimentare
figura suplimentară 1. Colocalizarea NDRG2 și GS în astrocite. Figura Suplimentară 2. Expresia proteinei NDRG2 în liniile celulare. (Materiale suplimentare)