mecanismele de acțiune ale Du-Huo-Ji-Sheng-Tang asupra degradării cartilajului într-un model de iepure de osteoartrită

rezumat

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) este un medicament tradițional chinezesc pe bază de plante utilizat pentru tratarea osteoartritei. În studiul de față, a fost investigat efectul terapeutic al DHJST asupra degradării cartilajului într-un model de iepure de osteoartrită. În articulațiile genunchiului iepurilor, s-a efectuat transecția ligamentului încrucișat anterior (ACLT) pentru a induce osteoartrita experimentală. La sfârșitul celei de-a șasea săptămâni, 30 de iepuri cu ACLT au fost împărțiți în șase grupuri, grupul de control, grupul DHJST și grupul Osaminethacine (OSA), care au fost urmate încă 4 săptămâni. Celelalte trei grupuri de iepuri cu ACLT au fost netratate cu DHJST sau OSA, care au fost sacrificate după 6 săptămâni și au servit ca controale de timp de 6 săptămâni. Rezultatele au indicat că la sfârșitul celei de-a șasea săptămâni după operație, a existat o degenerare histologică semnificativă în grupul de control comparativ cu grupul normal. În grupul de control, scorul mediu pentru degenerarea histologică a fost o creștere suplimentară la săptămâna a 10-a și a existat un scor mediu semnificativ mai mic pentru degenerarea histologică în grupul DHJST comparativ cu grupul de control. Pentru a cerceta mecanismul potențial, s-au detectat nivelul de Expresie al VEGF și HIF-1 inkt. Expresia ARNm VEGF și ARNm HIF-1 centi sunt scăzute în grupul normal, în timp ce activitățile cresc treptat în grupul de control. Cu toate acestea, în comparație cu cea a aceluiași grup de modele de puncte de timp, activitatea VEGF și HIF-1 inkt a scăzut semnificativ în grupul DHJST. În concluzie, DHJST exercită un efect terapeutic semnificativ asupra iepurilor de osteoartrită, iar mecanismele sunt asociate cu inhibarea expresiei VEGF și HIF-1 inkt.

1. Introducere

osteoartrita (OA) este o boală progresivă și debilitantă care poate dura ani de zile pentru a se manifesta clinic la persoanele afectate. Îmbătrânirea cartilajului și senescența condrocitelor joacă un rol important în patogeneza și dezvoltarea OA. În timpul dezvoltării OA, există adesea o creștere focală a morții celulare. O mulțime de rapoarte au arătat că senescența condrocitelor contribuie la riscul degenerării cartilajului prin scăderea capacității condrocitelor de a menține și repara țesutul cartilajului articular . Deoarece se teoretizează că fiecare condrocite este responsabil pentru menținerea matricei extracelulare care o înconjoară și că moleculele matricei produse într-o regiune a țesutului au o capacitate foarte limitată de a traversa țesutul, pierderea focală a celulelor viabile ar putea fi parțial responsabilă pentru incapacitatea țesuturilor de a repara daunele minore .

în prezent, nu există un remediu pentru OA, iar tratamentele disponibile încetinesc doar progresia bolii . În ultimii 20 de ani, medicina tradițională chineză (TCM) a înregistrat progrese semnificative împotriva OA, cum ar fi îmbunătățirea constatărilor clinice ale pacienților, inhibarea reacției inflamatorii și degenerarea cartilajului . Studiul in vivo și in vitro a arătat, de asemenea, că formula de plante din China este de mai multe acțiuni cuprinzătoare împotriva OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, care este compus din Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi și Poria, a fost utilizat pe scară largă pentru tratarea OA. Poate îmbunătăți simptomele clinice, funcția genunchiului și calitatea vieții pacienților . Pe baza cunoștințelor noastre despre patogeneza OA în TCM, am investigat efectul DHJST asupra prevenirii degenerării cartilajului OA la iepuri și am observat mecanismele sale.

2. Metode

2.1. Materiale

sistemul de detectare a apoptozei colorimetrice (TUNEL assay) a fost obținut de la Nanjing Jiancheng Biotech Company (China). Trizol total ARN extraction kit, ADN molecular marker, SYBR Premix ex TaqTM și kit Perfect Real Time au fost achiziționate de la Invitrogen Co. (SUA). Plante în DJST (compus din Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi și Poria, furnizate de Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., China) au fost acreditate de un farmacognozist conform protocoalelor standard, pregătite de Spitalul Municipal de Medicină Tradițională Chineză din Shanghai, componentele au fost amestecate în ordine cu raportul dintre 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (greutate uscată), medicamentele au fost extrase cu metode standard conform Farmacopeei Chineze (China Pharmacopeia și Comitetul, 2000). Aceste medicamente brute au fost înmuiate în apă distilată și fierte timp de 30 min de două ori, iar soluția de medicament a fost filtrată printr−o plasă, apoi filtratul a fost concentrat la 4 g mL-1 de către o pompă de vid și apoi depozitat la -20 C până la utilizare. Osaminethacine( OSA), fiecare comprimat conține indometacin 25 mg și aminoglucoză 75 mg (furnizat de Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., China), a fost folosit ca medicament de control pozitiv.

2.2. Iepurii și prepararea țesuturilor

iepurii albi din Noua Zeelandă în vârstă de patruzeci și opt de luni au fost furnizați de centrul experimental pentru animale Academiei Chineze de științe. Treizeci de iepuri au suferit o transecție unilaterală a ligamentului încrucișat anterior (ACLT) sub anestezie generală. Iepurii normali nu au fost supuși unei proceduri.

la sfârșitul celei de-a șasea săptămâni, cei 30 de iepuri cu ACLT au fost împărțiți în șase grupuri, grupul de control, grupul DHJST și grupul OSA, care au fost urmăriți încă 4 săptămâni. Celelalte trei grupuri de iepuri cu ACLT au fost netratate cu DHJST sau OSA, care au fost sacrificate după 6 săptămâni și au servit ca controale de timp de 6 săptămâni. Decocțiile au fost administrate oral la doza 0.923 g (kg−1·d−1) timp de 4 săptămâni, iepurilor din lotul OSA li s−a administrat OSA 0,09 g (kg−1·d-1) timp de 4 săptămâni, lotul martor model și lotul normal au fost administrate oral cu același volum de soluție salină fiziologică.

iepurii au fost sacrificați pentru prelevare. Protocolul a primit aprobarea Comitetului pentru experimente pe animale al Centrului Medical Universitar, Shanghai, China. Tibia de iepure a fost îndepărtată și cartilajul articular al tibiei a fost depozitat imediat la -80 C. Tibiile au fost disecate cu atenție și eliminate din mușchiul adiacent și fixate imediat în formalină 10% Timp de 24 de ore. Tibiile au fost ulterior decalcificate timp de 4 săptămâni în 100 g/l acid tetraacetic de etilendiamină, spălate în PBS, deshidratate printr-o serie de etanol și încorporate în parafină într-un mod standardizat pentru a asigura o orientare adecvată. Secțiunile de țesut de parafină (7 centimetri) au fost tăiate într-un mod standardizat. Secțiunile au fost deparafinizate pentru analize histochimice.

2.3. Evaluarea histologică a cartilajului

evaluarea histologică a fost efectuată pe articulațiile femorotibiale ale iepurilor din grupul DHJST, grupul OSA și grupurile de control. Secțiunile au fost colorate cu Safranin o-fast green. Aceste secțiuni histologice din fiecare sit au fost evaluate folosind un sistem modificat de clasificare a Mankin (Tabelul 1) de către doi patologi veterinari independenți, certificați de bord.

2.4. Testul TUNEL

apoptoza indusă de H2O2 a fost detectată prin efectuarea testului terminal deoxinucleotidedil transferază mediată de dutp nick end-labeling (TUNEL) folosind un kit Apo-DirectTM (CalBiochem, San Diego, CA). Tunelul a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, după pretratări și expunerea la H2O2, celulele au fost recoltate, spălate, fixate, permeabilizate și etichetate pentru pauzele de catenă ADN, apoi analizate pe un Citometru de flux Coulter Epics Elite (Beckman-Coulter, Miami, SUA). Toate testele au fost efectuate în trei exemplare.

2.5. PCR cantitativ Fluorescent

ARN Total a fost extras din 50 mg de cartilaj în articulația tibiei folosind reactiv Trizol. Sinteza ADNc s-a realizat folosind 4 hectar de ARN total per probă cu primeri și reactivi aleatori conținuți în trusa de sinteză a ADNc cu prima catenă Revert Aid. Doi micro litri (2 unqql) din fiecare probă au fost utilizați pentru PCR în timp real într-un sistem Rotor-Gene 2000 (Australia). Cuantificarea relativă a fost calculată folosind pragul ciclului delta () cuantificarea relativă. S-a determinat ciclul prag () pentru ARNm endogen de control CAPDH și semnalele țintă, iar cuantificarea relativă a ARN a fost calculată folosind metoda comparativă unde secvențele de primeri utilizate pentru factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) sunt: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(înainte) și 5′-GGCCCTGGGGTTTGAT-3(invers) (lungimea produsului: 75 bp).Secvențele de primeri utilizate pentru factorul inductibil de hipoxie-1 inkt (HIF-1 inkt) sunt: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(înainte) și 5 ‘ -CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3(invers) (lungimea produsului: 107 bp).Secvențele de primeri utilizate pentru GAPDH sunt: 5’-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(înainte) și 5 ‘ -GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(invers) (lungimea produsului: 88 bp).

2.6. Analiza statistică

toate rezultatele au fost exprimate ca deviație medie și standard (DS). Datele de măsurare au fost analizate utilizând o analiză unidirecțională a varianțelor (ANOVA, SPSS 11.0). Datele de rang au fost analizate cu ridit. Rezultatul P < .05 a fost considerat semnificativ statistic.

3. Rezultate

3.1. Degenerarea histologică indusă de ACLT la iepuri a fost redusă cu DHJST

secțiunile histologice reprezentative sunt prezentate în Figura 1. La sfârșitul săptămânii a 10-a, am observat o integritate normală a suprafeței articulare în grupul normal (Figura 1(a)). În grupul de control, cu degenerare crescută, a existat o pierdere de Safranină o-colorare verde rapidă care însoțește formarea fisurii care s-a extins în zonele medii și profunde (Figura 1(b)), iar în grupul DHJST, s-a pierdut cu fibrilație ușoară timpurie și s-a observat o pierdere de safranină o-colorare verde rapidă împreună cu gruparea condrocitelor (Figura 1(c)). Grupul OSA, cu pierderea colorației verzi Safranin o-fast aceste modificări au fost similare cu grupul DHJST (Figura 1(d)). La sfârșitul celei de-a șasea săptămâni după operație, au existat diferențe histologice semnificative în grupul de control comparativ cu grupul normal (P < .01). În grupul de control, scorul mediu pentru colorația Verde Safranin O-fast a fost o creștere suplimentară la săptămâna a 10-A în comparație cu cea din săptămâna a 6-a (P < .01) (Figura 2 (a)). La al 10-lea weekend, au existat diferențe semnificative în scorul Mankin între grupul de control și grupul DHJST, a existat un scor mediu semnificativ mai mic pentru colorarea verde Safranin o-fast în grupul DHJST comparativ cu grupul de control (P < .01) (Figura 2 (b)) și nu există diferențe semnificative statistic în scorul Mankin între grupul DHJST și grupul OSA (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Rezultatele au fost prezentate ca mijloace SD (n = 5 pe grup) în fiecare coloană. *P < .01 față de grupul de control al osteoartritei la săptămâna a 6-a, **P < .01, comparativ cu cei din grupul de control al osteoartritei.

3.2. DHJST inhibat apoptoza celulelor cartilaginoase

la sfârșitul celei de-a șasea săptămâni după intervenția chirurgicală, indicele celulei apoptozei din grupul de control comparativ cu cel din grupul normal au fost diferențe semnificative (P <.01). În grupul de control, indicele celulei de apoptoză a fost încă mult crescut (de la media SD la 0,35 la 0,13 la a șasea săptămână la 0,62 la 0,10 la a 10-a săptămână; P < .01) (Figura 2 (c)). La sfârșitul celei de-a 10-a săptămâni, comparativ cu grupul DHJST, indicele celulei de apoptoză crește remarcabil în grupul de control (P < .01) [Figura 2 (d)]. Nu au existat diferențe semnificative în indicele celulelor de apoptoză între grupul OSA și grupul DHJST (P >.05).

3.3. Inhibarea VEGF și HIF-1 expresie în celulele cartilaginoase sunt asociate cu DHJST exercită un efect terapeutic

fluorescente cantitative PCR a indicat faptul că expresia VEGF ARNm și HIF-1 ARNm sunt scăzute în grupul normal; în timp ce activitățile cresc treptat și semnificativ în grupul de control în comparație cu cea a grupului normal (P< .01); în grupul de control, HIF-1 la condrocitele articulare începe să crească la a șasea săptămână după operație, crește în continuare la A 10-a săptămână în comparație cu cea a celei de-a șasea săptămâni (media SD 94,21 la sută 20.12 la a șasea săptămână și 160,35 72,27 la a 10-a săptămână; P < .05) (Tabelul 2). La al 10-lea weekend, expresia ARNm VEGF și ARNm HIF-1 inqc în grupul DHJST a fost semnificativ scăzută în comparație cu cea din grupul de control după administrare (P < .01). Deși nivelul ARNm VEGF și ARNm HIF-1 la sută în grupul OSA a avut tendința de a fi redus cu 4 săptămâni de tratament cu OSA în comparație cu cel din grupul de control, nu a existat nicio diferență semnificativă (Tabelul 3).

4. Discuție

modelul ACLT este unul dintre cele mai utilizate modele experimentale de OA. Aclt de iepure este din ce în ce mai utilizat în studiile OA, deoarece debutul bolii este rapid. Utilizarea modelelor experimentale ACLT are o relevanță clinică deosebită, deoarece ruptura ACL apare la om și duce, de asemenea, la dezvoltarea OA. Studiul indică faptul că o cantitate mare de condrocite apoptoza există în timpul etapei progresive a OA la iepuri induse de o intervenție chirurgicală. Apoptoza condrocitelor este una dintre modificările caracteristice ale cartilajului OA. Apoptoza patologică în condițiile stimulării dăunătoare ar putea duce la eliberarea de chemotaxie sau factori inflamatori, care la rândul lor agravează leziunile cartilajului și activează durerea . Prin urmare, inhibarea apoptozei condrocite ar putea fi o strategie importantă împotriva modificărilor degenerative ale articulațiilor genunchiului iepurilor. Indicele de apoptoză condrocite în grupul DHJST scade semnificativ în comparație cu cel din grupul model, sugerând că inhibarea apoptozei condrocite ar putea fi unul dintre mecanismele importante ale DHJST împotriva modificărilor degenerative.

studiile anterioare au arătat natura hipoxică a micromediului condrocitelor articulare. Interesant este că articulațiile osteoartritice au prezentat în continuare niveluri scăzute de oxigen, rolul hipoxiei în timpul patogenezei OA . Un studiu recent a descris că în condrocitele articulare stresul catabolic și hipoxic sunt inductori puternici ai factorului de transcripție HIF-1, Care este principalul regulator al adaptării celulare la niveluri scăzute de oxigen. HIF – 1 are o importanță esențială pentru supraviețuirea și stoparea creșterii condrocitelor în timpul dezvoltării cartilajului, precum și pentru generarea de energie și sinteza matricială a condrocitelor în cartilajul sănătos și osteoartritic. În cartilajul osteoartritic, nivelurile de proteine ale HIF-1 sunt semnificativ crescute, iar activitatea sa se corelează cu severitatea modificărilor degenerative ale cartilajului . Lucrarea de față documentează importanța factorului de transcripție HIF-1 pentru menținerea integrității cartilajului articular hipoxic. Nivelurile excedentare de HIF-1 inktif au coincis cu apoptoza crescută a condrocitelor articulare și au dus la modificări degenerative ale articulațiilor genunchiului iepurilor. După administrarea de DHJST, expresia HIF-1 inqc scade, în comparație cu cea a grupului model. Rezultatele arată că acțiunea DHJST asupra funcției de reglare a condrocitelor, s-ar putea prin inhibarea activității HIF-1 inkt.

este interesant faptul că diferitele expresii ale VEGF și HIF-1 inqq între grupul DHJST și grupul OSA sunt semnificative după administrare. Mai multe studii au demonstrat că anumite medicamente antiinflamatoare nesteroidiene, cum ar fi indometacinul, provoacă efecte antiinflamatorii independente de activitatea HIF-1 XV, deoarece indometacinul nu a reușit să inhibe fosfatidilinozitolul 3-kinaza sau calea kinazei reglate de semnal extracelular/protein kinazei activate de mitogen, precum și activitatea Erk . În schimb, indometacinul este capabil să activeze receptorul activat de proliferator peroxizom-ingust, care nu este sensibil la salicilatul de sodiu sau aspirina. Inhibarea căii de fosfatidilinozitol 3-kinază sau Erk este legată de inhibarea factorilor HIF-1 și a factorilor angiogeni .

hipoxia și diverși factori de creștere / citokine sporesc expresia VEGF . VEGF nu este doar unul dintre cei mai importanți factori de angiogeneză, dar este implicat și în procesele inflamatorii din OA și contribuie la simptome precum durerea și umflarea prin direcționarea membranelor sinoviale , răspunsurile inflamatorii cronice sunt adesea asociate cu producerea de factori angiogeni care induc proliferarea vasculară, iar în artrita reumatoidă VEGF este foarte exprimată în celulele sinoviale . Deoarece supraîncărcarea mecanică este unul dintre factorii cauzali ai OA, am studiat efectul său asupra expresiei VEGF asupra cartilajului iepurelui că expresia VEGF scade după administrarea DHJST, rezultatul indică faptul că DHJST poate proteja cartilajul articular prin suprimarea expresiei VEGF în condrocite (Figura 3).

Figura 3

mecanisme ipotetice de protecție ale DHJST asupra degradării cartilajului.

5. Concluzii

până în prezent, ingredientele bioactive din DHJST nu sunt cunoscute, dar studiul nostru indică faptul că DHJST exercită un efect terapeutic semnificativ asupra OA la iepuri, prin mecanisme de inhibare a apoptozei condrocitelor și de reglare a expresiei VEGF, HIF-1 la condrocite. Aceasta oferă dovezi științifice pentru ca clinica să aplice DHJST în tratarea OA.

finanțare

Fundația pentru științe Naturale din Shanghai (numărul grantului: 08JC1418800).