4.3 BBB-crossing bsAbs proiectat cu anticorpi cu un singur domeniu
sdab-urile sunt mici (15 kDa), fragmente monomerice de legare a antigenului de anticorpi care oferă diverse avantaje față de alte fragmente de anticorpi ca „blocuri de construcție” pentru bsAbs. Ele apar în natură ca porțiunea de legare a antigenului a anticorpilor cu lanț greu la speciile de camelide (numite VHH) și peștii cartilaginoși (numiți VNAR) sau pot fi generați din IgG-uri convenționale prin obținerea sau ingineria domeniilor monomerice, stabile VH sau VL (Hamers-Casterman și colab., 1993; Hussack și colab., 2012; Kim și colab., 2014; Nuttall, 2012; Ward, G Inksssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdab – urile sunt foarte stabile și compacte și pot accesa epitopi încastrați în proteine, cum ar fi cavitățile receptorilor sau siturile active ale enzimelor, care sunt adesea „ascunse” de IgG-urile convenționale și pot atinge afinități de legare țintă comparabile cu cele ale anticorpilor convenționali (Lauwereys și colab., 1998; Staus și colab., 2014). Aceste unități monomerice de legare a antigenului nu se împerechează cu lanțuri ușoare, ceea ce le face blocuri excelente pentru bsab-urile heterodimerizate, deoarece evită dificultățile de asociere necorespunzătoare a lanțului ușor (Hamers-Casterman și colab., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Bsab-urile heterodimerice pot fi create cu unul sau ambele „brațe” fiind sdAb, acesta din urmă fiind similar ca structură cu anticorpii cu lanț greu camelid (Fig. 3E). sdab-urile pot fi, de asemenea, utilizate în diferite fuziuni mono -, bi-sau tetravalente cu anticorpi terapeutici convenționali sau Fab-uri (Fig. 3e), rezultând în general molecule mai mici, mai puțin complexe, comparativ cu cele generate cu scfv-uri sau Fab-uri ca blocuri de construcție, care tind să fie bine comportate biofizic și ușor de produs (Holliger & Hudson, 2005). Umanizarea VHHs, precum și ingineria sdab-urilor este bine descrisă, permițând generarea cu ușurință a sdab-urilor umane(izate) cu afinitate țintă optimă și proprietăți biofizice excepționale (Vincke și colab., 2009).
pentru a evalua utilizarea potențială a camelidei VHH FC5 ca purtător BBB în cadrul anticorpilor bispecifici care vizează SNC, fuziunile monovalente și bivalente (N-și C – terminal) ale FC5 cu Fc uman au fost proiectate și evaluate in vitro și in vivo (Farrington și colab., 2014). Afinitatea aparentă de legare (Kdapp) la BEC de șobolan a fuziunii bivalente FC5Fc a fost de 75 nM, în timp ce legarea monovalentă FC5Fc a fost în intervalul micromolar. Analizele ratelor de transmigrare aparente (Papp) pe un model BBB in vitro, expunerea aparentă la SNC derivată din farmacocinetica serică/LCR a constructelor de anticorpi administrate sistemic și răspunsurile farmacologice obținute de peptidele neuroactive impermeabile BBB conjugate chimic în modelul durerii Hargreaves, au furnizat dovezi ale transportului BBB îmbunătățit al acestor molecule mari de anticorpi (75 kDa) mediate de FC5: (1) valorile Papp in vitro au fost de ~ 200 cm/min atât la 4-8 cm/min pentru controlul VHH A20.1FC sau EG2Fc; (2) expunerea aparentă la SNC a fuziunii FC5Fc a fost de 30 de ori mai mare comparativ cu fuziunile anticorp-Fc din domeniul de control; (3) potența farmacologică sistemică a conjugatelor FC5Fc cu neuropeptide dalargin sau galanin în modelul durerii inflamatorii Hargreaves a fost de până la 60 de ori mai mare comparativ cu conjugatele monomerice FC5–neuropeptide. Acest rezultat a fost atribuit timpului de înjumătățire circulator lung (~96 h) Al FC5Fc-comparativ cu conjugatele NEUROPEPTIDICE FC5; (4) diferiți conjugați neuropeptidici VHH–Fc de control nu au prezentat eficacitate sistemică; (5) fuziunea FC5 la capătul C al Fc a dus la atenuarea capacității de trecere BBB. Spre deosebire de anticorpii purtători BBB care vizează TfR, atât proteinele de fuziune FC5Fc mono-cât și cele bivalente au prezentat o rată similară de transcitoză in vitro, profiluri farmacocinetice plasmatice/CSF similare și potență sistemică similară în modelul farmacodinamic in vivo, în ciuda diferențelor de afinitate aparentă de legare și valență (Farrington și colab., 2014). Aceste studii au demonstrat că anticorpul FC5 cu un singur domeniu de trecere BBB poate fi utilizat ca platformă BBB purtător în ambele „semi-anticorpi” heterodimerizați și ca fuziune bi – sau tetravalentă mai ușor scalabilă la IGG-urile convenționale (Farrington și colab., 2014).
Un alt avantaj potențial al VHHs ca purtători BBB este rezistența lor naturală la provocări biofizice extreme, cum ar fi temperatura și pH-ul, precum și la degradarea proteazei (Kim și colab., 2014), adesea întâlnită în diferite compartimente endocitare în timpul transcitozei. Atât fuziunile FC5, cât și FC5Fc sunt internalizate în BEC prin vezicule acoperite cu clatrin și sunt sortate la endozomi timpurii. Interesant este că FC5 a fost, de asemenea, găsit pentru a stimula vărsarea microvesiculelor extracelulare (exosomi) de la BEC (Haqqani, Caram-Salas și colab., 2013; Haqqani, Delaney și colab., 2013) în care atât FC5, cât și nivelurile crescute ale receptorului său presupus Cdc50A au fost detectate de Western blot și spectrometrie de masă vizată. Acest studiu a sugerat că exozomii vărsați pot fi vezicula finală a căii RMT eliberată de suprafața abluminală care transportă complexul receptor-anticorp (prezentat schematic în Fig. 4). Calea RMT și formarea exozomilor împărtășesc unele asemănări notabile. Așa cum s-a subliniat în prima descoperire a exozomilor, un anticorp anti-TfR a fost urmărit prin microscopie electronică în reticulocite (TH Oqustry, 2011) de la suprafața celulelor, în gropi acoperite cu clatrin, în interiorul endozomilor timpurii, pe suprafața veziculelor interne ale endozomilor multivesiculari și în final pe exozomii eliberați după fuziunea endozomilor multivesiculari cu membrana plasmatică (Fig. 4). RMT pare să se desfășoare într-un mod similar, iar MICROVESICULELE extracelulare BEC s-au dovedit a conține mai mulți receptori despre care se știe că transportă macromolecule prin BBB prin RMT, inclusiv TfR, LRPs, LDLR și IR (Haqqani, Delaney și colab., 2013).
din studiile descrise, ar trebui să fie evident că brațul purtător BBB al bsAb care vizează SNC necesită o optimizare atentă pentru fiecare receptor RMT. Considerații importante în proiectarea bsab-urilor de direcționare a SNC sunt discutate mai jos, având în vedere „lecțiile învățate” din dezvoltarea TfR-BACE1 bsAb și din propria noastră lucrare cu FC5 ca anticorp purtător BBB.